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稀有人参皂苷IH901酶法转化与制备研究

2014-08-04 抗癌健康网

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  稀有人参皂苷IH901酶法转化与制备研究

  摘 要:本研究利用酶制剂蜗牛酶,酶法转化三七二醇组皂苷制备稀有人参皂苷IH901,正交实验优化酶解条件,建立酶法转化工艺。结果表明:超声法提取三七总皂苷正交实验优化条件为用75%乙醇溶液, 15倍溶剂用量,超声波提取210min作为最佳条件,三七总皂苷得率为12. 21%;酶法转化二醇组人参皂苷制备稀有人参皂苷IH901,正交实验优化的条件为物料比为6/1、反应时间9 h、反应温度为45℃、pH值为3. 0,酶解得率为54124%;经硅胶柱分离获得IH901单体化合物,HPLC测定纯度达98%。酶法转化制备皂苷IH901的工艺方法简便,切实可行,可为中试生产提供参考。

  关键词:二醇组人参皂苷;酶法转化;稀有人参皂苷IH901

  三七为五加科人参属植物(Panax notoginseng(Burk) F. H. Chen),人参皂苷是三七的主要有效成分,其中二醇组人参皂苷含量占大部分。人参皂苷长期以来是人参类药材药理药效学研究的热点,近年来研究表明天然二醇组人参皂苷如Rb1、Rb2 等口服后由肠道细菌所分泌的糖苷酶选择性水解C23位糖配体,生成仅在C220位保留一个葡萄糖的次生皂苷,称为稀有人参皂苷IH901(CompoundK,人参皂苷M1) (图1)。IH901被认为是二醇组人参皂苷的最终药用活性形式,在抗肿瘤、抗衰老,抗炎症等方面均表现较高活性。鉴于IH901药物的应用前景,目前制备人参皂苷IH901的研究备受关注,由于其是肠道菌代谢的产物,在自然界不存在而无法从人参类药材中直接分离获得,主要通过微生物发酵转化和酶法转化的方法将人参皂苷在体外进行改造获得,其研究目标主要锁定在对人参二醇型皂苷C23和C220位的糖基结构修饰,即利用生物修饰方法进行人参皂苷糖基改造,使人参、西洋参中含量较高的二醇型人参皂苷Rb, Rc,Rd等的糖基经过水解作用,定向转化为稀有人参皂苷IH901。本文通过植物化学方法,研究从三七中获得二醇组皂苷酶解原料,利用酶制剂蜗牛酶转化制备稀有人参皂苷IH901,正交试验优化酶解反应条件,最终确定利用三七二醇组皂苷体外酶转化法制备稀有人参皂苷IH901的工艺流程。

  

 

  1 材料与方法

  1.1 实验材料

  三七药材购自厦门光华大药房,对照品人参皂苷Rb1、Rc、Rd、Re、Rg1 购自中国药品生物制品检定所;对照品人参皂苷IH901由山东省天然药物工程技术研究中心提供(纯度大于98%); 蜗牛酶(snailase)、柚皮苷酶(naringinase)和木聚糖酶(xyla2nase)购自SigmaChemical Co;果胶酶(Pectolase)和纤维素酶(Cellulase)购自Yakult of Japan;β2葡聚糖苷酶(β2glucanase)购自Fluka

  1. 2 仪器与试剂

  旋转蒸发仪(EyelaCorporation);紫外分光光度计(上海UnicoUV22802H);冷冻干燥机(Thermo,Modul Yod2230);液相色谱仪(Agilent 1100);核磁共振仪(AV2400BrukerBioSpin);乙腈购自merck公司,其它化学试剂均为国产分析纯试剂。

  1. 3 实验方法

  1. 3. 1 超声波法提取三七总皂苷

  称取三七粉末样品,加入10倍量95%乙醇,超声提取60min,抽滤,滤液减压浓缩成浸膏,加少量的超纯水溶解,用乙醚脱脂脱色后,正丁醇多次萃取获得三七总皂苷;为优化提取条件,称取9份20g样品,选定对提取率影响较大的溶剂用量、超声时间和乙醇浓度作为考察因素,每个因素取3个水平,按照三因素三水平正交设计进行正交试验,考察不同因素对总皂苷提取的影响,确定三七总皂苷最佳提取条件。

  1. 3. 2 硅胶柱分离制备二醇组皂苷

  硅胶G(200~300目)于110℃活化60min,湿法装柱,三七总皂苷用少量洗脱剂CHCl3: n2BuOH:MeOH: H2O(20: 40: 15: 20下层)溶解,上样于硅胶柱介质顶部;用洗脱剂冲洗,等量收集;用薄层层析鉴定收集洗脱液,合并相同组份,减压浓缩,冻干备用。

  1. 3. 3 酶法转化制备稀有人参皂苷IH901

  1. 3. 3. 1 最佳转化酶的筛选

  选用果胶酶、纤维素酶、蜗牛酶、β2葡聚糖苷酶、柚皮苷酶和木聚糖酶6种酶作为筛选对象;二醇组皂苷与酶以物料比8: 1溶解于pH4. 6的磷酸2柠檬酸缓冲液中;在40℃恒温水浴中反应24、48、72、96h,每隔24h取各实验组离心管;终止反应,加入正丁醇溶液分三次萃取,萃取液浓缩用甲醇溶解定容;通过TLC检测不同酶解反应时间内的酶解产物,根据TLC的斑点和颜色深浅判定酶解产物,比较不同酶的酶解作用大小。

  1. 3. 3. 2 酶法转化的正交优化

  根据酶筛选结果,选择物料比、反应时间、反应温度和pH值作为考察因素,每个因素设3个水平,采用L9(34)正交实验优化酶法转化。按正交设计的物料比加入二醇组皂苷和酶,在一定温度、pH值下反应;终止反应后离心获得反应酶解物,沉淀用蒸馏水洗涤,然后用少量甲醇多次溶解,离心,用容量瓶中定容至10mL。根据药典紫外分光光度计法测定酶解物含量,以IH901标准品作标准曲线,得到浓度在0~50μg/mL之间回归方程: Y=0. 0192X -010019(r2=0. 9996),根据回归方程计算产物浓度,按公式:酶解物得率%=(10×酶解物浓度/二醇组皂苷原料量) ×100%计算酶解物得率。

  1. 3. 4 稀有人参皂苷IH901分离纯化和纯度测定

  将1. 2g粗制酶解物溶于少量洗脱剂中,湿法上样于硅胶柱(2×30cm)顶部;用氯仿和甲醇为洗脱剂梯度洗脱,用TLC检测收集组份,合并含目的物组份,减压浓缩,结晶得稀有人参皂苷IH901;化合物经波谱结构鉴定,纯度测定采用高效液相色谱(HPLC)外标法。色谱条件:色谱柱为C18柱Di2mension(150×4. 6mm);柱温: 25 ℃;检测波长:203nm;流速: 1. 0mL/min;流动相:水2乙腈(20:80);进样量为10μL。外标法测定以标准品IH901为对照品;精密称取对照品和供试品,配制成溶液,分别精密取10μL注入仪器,记录色谱图,测定对照品和供试品主成分的峰面积,按公式:供试品浓度=(供试品峰面积/对照品峰面积) ×对照品浓度计算出供试品浓度,按公式:纯度=(供试品浓度×供试品配制体积) /供试品称取的量×100%计算制备的IH901样品的纯度。

  2 结果与分析

  2. 1 正交实验优化超声波法提取三七总皂苷的结果

  参考罗晓健等测定方法,测定样品中总皂苷含量,以药材中总皂苷含量为考察指标,正交试验测定结果见表1。由极差R可知,各因素对三七总皂苷提取的影响程度的依次顺序为A(溶剂用量) >B(时间) >C(乙醇浓度%),即溶剂用量对三七总皂苷的提取影响最大,其次是提取时间,而乙醇溶度影响最小,同时确定该实验的最佳因素优化条件应该为A2B3C2,即用75%乙醇溶液, 15倍的溶剂用量,超声波提取210min作为最佳优化条件,根据优化的条件进行验证实验,结果在最佳优化条件下提取总皂苷得率为12. 21%,该得率大于正交实验各组总皂苷得率。

  

 

  2. 2 三七总皂苷和二醇组皂苷的TLC鉴定

  取制备的三七总皂苷用甲醇溶解, TLC检测用正丁醇:乙酸乙酯:水=4: 1: 5为展开剂, 10%硫酸乙醇溶液为显色剂,显色后皂苷呈不同程度的紫色(图2)。从图可知三七总皂苷中含有常见的二醇组皂苷和三醇组皂苷,与2005版药典鉴定图谱基本一致。三七总皂苷经硅胶柱分离,不同皂苷由于极性的差异被逐渐洗脱分离,收集的组份经TLC跟踪检测获得3个组份,记为组份A、B和C。三个组份的TLC鉴定图谱(图3),由图可知:组份A主要含有人参皂苷Re和Rg1 为主的三醇组皂苷,组份B主要含人参皂苷Rb1 为主的二醇组皂苷,而组份C主要含齐墩果酸型皂苷,从而证明用硅胶柱层析得到分离的二醇组皂苷和三醇组皂苷。

  

 

  

 

  

 

  2. 3 转化酶的筛选

  根据《中华人民共和国药典》,HPLC和TLC均是人参皂苷定性分析检测方法, HPLC方法灵敏度高,但TLC方法简单方便。本实验筛选6种酶不同时间对二醇组皂苷转化效果,样品量大故选用快速简便的TLC作为检测方法。根据TLC的斑点和颜色深浅判定6种酶在不同时间内酶解产物的变化,结果表明果胶酶、蜗牛酶、纤维素酶和柚皮苷酶96h内均能转化二醇组皂苷为IH901,β2葡聚糖苷酶和木聚糖酶转化能力较差。蜗牛酶在24h内就出现大量转化产物皂苷IH901,中间产物少,酶解转化效率最高,因此确定最佳转化酶为蜗牛酶。

  2. 4 正交实验优化酶法制备IH901工艺的结果

  测定酶解物中皂苷含量,以酶解物中皂苷含量为考察指标,正交实验结果见表2。由表中极差R大小,可知各因素对蜗牛酶酶解转化二醇组皂苷反应的影响大小顺序为a(物料比) >c(温度) >d(pH值) >b(时间h),即物料比对酶解反应影响最大,其次是反应温度,最后是pH值和时间,同时得出a2b2c1d1 组合为最佳工艺优选,即在温度为45℃条件下,在pH为3. 0的缓冲溶液中以物料比为6: 1组成反应底物和酶的混合物、酶解反应9h作为最佳优化条件。根据优化条件进行验证实验,结果在最佳优化条件下酶解产物得率为54. 24%,该得率大于正交实验各实验组的酶解物得率,从而证明了正交优化的效果。

  

 

  2. 5 柱层析分离纯化稀有人参皂苷IH901及其纯度测定

  通过硅胶柱柱层析,以氯仿:甲醇=9: 1~4: 1为洗脱剂梯度洗脱,用TLC检测收集组份,减压浓缩,结晶,获得目的化合物IH901, TLC鉴定图谱(图4),可知经过硅胶柱层析有效去除酶解产物中的杂质,纯化后TLC检测为单斑点,且纯化物和对照品IH901的混合物TLC也为单斑点,二者Rf 值相同,可初步判定为二者为同一化合物。1. 2g粗制酶解物经硅胶柱柱层析分离获得IH901为0. 4111g,柱层析分离纯化得率为34. 26%。

  对照品IH901高效液相色谱图见图5A,纯化得到的IH901进行HPLC分析,得到化合物的单峰图谱,峰型对称(图5B),同时以稀有人参皂苷IH901对照品为外标,精确吸取对照品IH901溶液和制备的目的化合物IH901溶液各10μL,注入HPLC仪,用外标法测定IH901的纯度,测定结果显示所得化合物的纯度在98%以上。

  

 

  

 

  2 讨论

  IH901是二醇型人参皂苷转化而来的非天然人参皂苷,由于3位和20位糖苷键的特异性,制备只能通过生物转化方法获得,转化方式通常有酶转化和微生物转化方法。由于酶转化法具有酶解反应温和,条件易于控制,操作方便且利于工艺研究开发等优点,酶法转化成为制备稀有人参皂苷的主要研究方法。目前据报道所用的酶主要有柚苷酶、果胶酶、纤维素酶及乳糖酶工业酶制剂转化二醇型人参皂苷混合物来制备IH901;也有直接从具有转化活性的菌株中分离专一性更强的转化酶,如从食用微生物Bifidobacterium sp. Int57和Bif. sp. SJ32中提取的粗酶, 来转化人参皂苷Rb1, Rb2 和Rc制备IH901;也有从人肠道菌FusodobacteriumK260分离纯化的4聚体β2葡萄糖苷酶,直接转化Rb1生成IH901。但是,上述转化方法普遍存在酶解转化时间长、酶解产物转化率不高、转化酶来源困难、纯化复杂且难度大等问题,制备方法还无法应用于工业化生产。

  本文通过实验比较,研究了6种酶转化二醇组人参皂苷的效果,酶对二醇组皂苷转化作用大小依次为蜗牛酶>果胶酶>柚皮苷酶>纤维素酶>β2葡聚糖苷酶>木聚糖酶。蜗牛酶在24h内就出现大量转化产物皂苷IH901,酶解得率为54. 24%,酶转化效率最高。蜗牛酶是一种含有多种具有糖苷键水解能力的复合酶,可能由于不同酶之间相互协同水解二醇组皂苷上的C20位和C3 位糖苷键,从而表现出该酶解转化的高效率。本研究正交优化结果为物料比对酶转化作用的影响最大,而姜彬慧等利用β2葡聚糖苷酶对三七茎叶总皂苷进行转化,结果为反应时间影响最大,其次是酶的体积分数,表明不同的酶酶解转化影响因素不同。

  本工艺中就稀有人参皂苷IH901的转化制备考虑了药物来源、提取方法、转化方法等三大关键技术环节,分别体现了低成本,提取简便和高转化效率等方面,工艺优化结果稳定,方法可行,建立的制备工艺流程可用于规模化生产,为稀有人参皂苷IH901的临床应用奠定基础。

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