人参皂贰Rh2对小鼠黑色素瘤B16细胞的分化诱导作用研究

　　人参皂贰Rh2对小鼠黑色素瘤B16细胞的分化诱导作用研究

　　摘要 本文首次报道人参皂苷Rh2对体外培养的低分化高恶性度的黑色素瘤B16细胞具有很强的分化诱导作用如黑色素生成能力明显增加细胞形态向正常上皮样细胞分化，使痊细胞的增殖阻断在G1期。其作用呈现浓度和时间依翰性。

　　关键词 参皂苷Rh2 分化诱导 黑色素瘤B16细胞

　　传统的癌的化学治疗主要着眼于癌细跑的杀伤。但是同时也极大地杀伤正常细胞,对造血等增殖较快的组织的毒性尤为常见。这些难以避免的毒副作用成为其进一步发展的障碍。癌可以看作是细胞分化异常的疾病，至少某些恶性肿瘤是其细胞分化受阻的结果,所以癌的分化治疗已成为一个重要途径和前沿。

　　人参皂苷Rh2是红参中的微量成份，其含量约十万分之一。用化学转化法制备大量的Rh2 ,使其有可能应用于临床对恶性肿瘤的治疗。本文采用恶性度高、低分化型的黑色素瘤B16 细胞,探讨人参皂苷Rh2的分化诱导作用和一些抗癌机制。

　　一、材料与方法

　　1、药品与试剂

　　人参皂苷Rh2自备,用时溶于少量DMSO,用95%乙醇稀释成储备液。DMSO及95%乙醇为北京化工厂产品。

　　2、仪器

　　Shimadzu MPS—2000多功能分光光度计;瑞士PASI型流式细胞光度计。

　　3、细胞来源及培养

　　试验用细胞株系从C57BL/6J小鼠传代的B16黑色素瘤建立的体外培养细胞株。在含10%小牛血清的EPMI—1640培养基中培养，用时0.25%胰酶消化。

　　4、B16细胞生长曲线的测定

　　取对数生长期的细胞配成浓度为1*104/ml细胞悬液，分装于培养瓶中，每组3瓶，于接种细胞的第二夭给药对照组加人等体积的溶剂,给药后置于含5%CO2的培养箱中37℃培养。于给药后不同时间,用胰酶消化,取一定量细胞,按台盼蓝排斥法,光显微镜下计数活细胞数。

　　5、黑色素含量测定

　　B16细胞以1*104/ml接种于20ml培养瓶中，第二天用不同浓度的Rh2处理细胞，对照组加等体积的溶剂，“Rh2”作用一定时间后，用PBS洗涤二次，1000rpm离心10分钟。将细胞溶于1N NaOH和10%DMSO中，放置30分钟，在400nm波长处测吸光度值。

　　6、形态学观察

　　将经“Rh2”处理后的B16细胞,直接在倒置显微锐下观察其形态变化。

　　7、流式细胞光度计分析

　　收集药物处理后的各组细胞,1000rpm离心5分钟，弃去上清液，细胞沉淀用95%乙醇在4℃冰箱内固定12小时以上。取固定后的细胞约106个,移入园口瓶内，加入0.5%胃蛋白酶0.5ml，室温下轻轻摇动，消化一定时间后加入2.5mg/mg的DAPI溶液0.25ml，3mg/100ml的SR101溶液2.0ml，混匀后用PASI型流式细胞光度计做单参数分析，每个样品测定20000个细胞，实验数据用类积分线分割法计算各期细胞所占比例。

　　二、结果

　　1、人参皂苷Rh2处理B16细胞不同时间，可见Rh2对B16细胞生长抑制作用呈浓度和时间依赖性，40μg/ml浓度的Rh2对B16细胞生扎具有显著的抑制作用。

　　2、人参皂苷Rh2对B16细胞给色素含量的影响

　　黑色素瘤细胞B16具有合成黑色素得功能，与与正常黑色素细胞相比,黑色素合成能力低。当被诱导分化时黑色素生成能力增加。Rh2在10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml浓度下刺激黑色素的生成，而且随着浓度的增加作用加强。并且黑色素增加随着生长抑制加强而加强。

　　3、人参皂苷Rh2对B16细胞形态的影响

　　B16细胞在体外呈多层生长，具有小数圆形细胞，Rh210μg/ml时，细胞呈极性生长，平行排列，在高浓度(40μg/ml)时，短时间内细胞生长同底浓度下生长相似，随着时间延长细胞呈网状结构，生长变缓慢。

　　4、Rh2对B16细胞周期移行得影响

　　流式细胞仪证明Rh2 10~20 μg/ml处理的B16细胞，被阻断于GT1期。药物作用后的细胞G1期明显增加，S期明显减少。(见表1)

　　三、讨论

　　以上实验结果证明,B16抑制黑色素瘤细胞B16的增殖,黑色素生成能力明显增加,形态上向正常上皮祥细胞分化。通过上述增殖能力的降低,形态的改变以及黑色素合成的增加,可以认为人参皂贰Rh2能诱导B16细胞的分化。细胞动力学结果表明Rh2可以使B16细胞阻断在G1期,进一步证明有分化诱导作用。

　　人参皂贰Rh2的抗癌机制与传统的化学药物不同,它不是细胞毒,不直接杀伤癌细胞,而是通过对癌细胞的分化诱导来实现抑止癌细胞的增殖、改变癌细胞机能的二大作用。使机体异常增生的细胞得以改变。

　　由于人参皂苷Rh2具有使癌细胞和向正常上皮样细胞分化的能力,细胞平行排列、呈网状细胞。这提示在癌的手术治疗前和手术治疗后应用，就可能提高手术治疗效果。本实验结果预示人参皂苷Rh2极可能成为一种以分化诱导作用为主要抗癌机制，无(低)副作用的抗肿瘤药物。