人参皂苷Rh2对SP2O骨髓瘤细胞的作用及其机制的初步探讨

李世辉1 , 　魏影非13, 　封江彬2 , 　陆　雪2 , 　刘青杰2 , 　杜惠兰3

(1. 河北省人民医院,河北省石家庄050051; 2. 中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所,北京100088; 3. 河北医科大学中西医结合学院,河北省石家庄050091)

基金项目:博士(后)基金项目计划(975467173D)

作者简介:李世辉(1971～) ,男,主治医师,医学博士,从事恶性血液病研究,电话: 13931177987, E2mail lshh2003@eyou. com

3 通讯作者:魏影非,河北省人民医院血液科,电话: 0311285988084, E2mail yingfeiwei@163. com

关键词:人参皂苷Rh2 ; 多发性骨髓瘤;巨噬细胞炎症蛋白21α; 肿瘤坏死因子α; 细胞凋亡

摘要:目的:观察人参皂苷单体成份Rh2 (G2Rh2 )对于骨髓瘤细胞SP2 /O的作用并对其可能的机制进行了初步探讨。

方法:应用10μg/mL至120μg/mL 6个不同浓度的人参皂苷单体成份Rh2 干预SP2 /O细胞72 h后,利用MTT法检测细胞增殖抑制作用;并分别在24 h和48 h,利用流式细胞术检测SP2 /O细胞凋亡率及细胞周期;常规Giemsa染色和DAP I荧光染色后观察SP2 /O凋亡细胞的形态学变化;利用酶联免疫吸附(EL ISA)法,测定药物干预前后细胞上清液中肿瘤坏死因子α( TNFα) 、巨噬细胞炎症蛋白21α(M IP21α)的水平。结果: G2Rh2 在10μg/mL至120μg/mL的浓度范围内均能抑制SP2 /O细胞生长增殖,呈剂量依赖性; G2Rh2 可诱导SP2 /O细胞凋亡,呈现出时间剂量依赖性。24 h后, 60μg/mL的浓度诱导凋亡的作用较明显; 48 h后, 80μg/mL的浓度诱导凋亡的作用较明显; G2Rh2 作用后, G0 /G1、G2 /M期细胞数目减少, S期细胞明显增加; G2Rh2 干预不影响TNFα、M IP21α的产生。结论: G2Rh2 对SP2 /O骨髓瘤细胞有明显的增殖抑制和诱导凋亡作用,且这种作用有周期特异性。

中图分类号: R285. 6　　　　　文献标识码: B　　　　　文章编号: 100121528 (2006) 0721047203

多发性骨髓瘤(Mulhp le myeloma,MM)是影响老年人身心健康的恶性肿瘤之一。由于其发病机制尚不清楚且缺乏有效的治疗手段,MM的治疗效果并不理想。传统化疗药物普遍存在着选择性差、毒副作用大、易产生耐药性等问题。因此,需要探寻新的治疗药物及治疗手段。人参作为我国传统的名贵中草药材,具有安神益智、生津固脱、调补五脏、强精通脉、延缓衰老、抗辐射、抗肿瘤等多种生物学活性,人参皂苷是其主要活性成分。现已分离出40余种人参皂苷单体,其中G2Rh2 具有显著的抗肿瘤活性,如诱导黑色素瘤细胞分化[ 1 ]、逆转白血病细胞耐药[ 2 ]、通过调节蛋白激酶C的活性[ 3 ]及糖皮质激素样受体作用抑制肿瘤细胞的增殖[ 4 ] ,但其对骨髓瘤细胞的作用尚未见到报道。本研究就G2Rh2 对于SP2 /O骨髓瘤细胞的作用及其可能的机制进行了初步探讨。

1　材料与方法

1. 1　药品与试剂

人参皂苷Rh2 (纯度> 98 ) ,购于深圳思味特科技有限公司。溶于磷酸盐缓冲液( PBS)中配成1000μg/mL 母液,超滤除菌, - 20 °C保存。四甲基偶氮唑蓝(MTT) 、RP2M I1640培养液、小牛血清、胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO) ,均为美国Biowares公司产品。其余试剂均为国产分析纯。

1. 2　细胞培养

小鼠骨髓瘤细胞株SP2 /O,由河北医科大学生物科技总公司提供。用含10 小牛血清的RPM I1640 培养液,加入NaHCO3 2. 2 g/L、青霉素100 U /mL 和链霉素100 g/mL,置37 °C、5 CO2 温箱培养中传代培养,所有实验均在细胞处于对数生长期时进行。

1. 3　Rh2 抑制SP2 /O细胞增殖作用的量效关系试验当天,细胞用胰酶消化后用Hank’s液将细胞洗下、离心;用胎盘兰染色,镜下计数活细胞数,用1640培养基调细胞浓度为2 ×105 /mL;将细胞接种于96孔培养板中,每孔加细胞悬液200μL,每组3个复孔,共设8个组。加入G2Rh2 ,其终浓度分别为0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100,110, 120μg/mL。置37 °C、5 CO2 培养箱中培养72 h。离心去上清,每孔加1 ∶1稀释的MTT(5 mg/mL) 20μL, 37 °C培养4 h后,加入酸化异丙醇200μL使颗粒溶解,用酶标仪测570 nm处吸光度。计算抑制率,抑制率( ) = (1 - 试验孔OD570 /对照孔OD570 ) ×100 。

1. 4　用流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期

试验当天,细胞用0. 25 胰酶消化,用Hank’s液将细胞洗下、离心;用胎盘兰染色,镜下计数活细胞数,用1640培养液调细胞浓度为1 ×106 /mL。将细胞接种于24孔培养板中,每孔加细胞悬液1 mL,共7个组(2块板) , G2Rh2 浓度分别为0, 20, 40, 60, 80, 100μg/mL,置37 °C, 5 CO2 培养箱中分别培养24 h和48 h。将细胞取出,用PBS洗2次,用70乙醇固定(4 ℃) ,送检前离心、弃上清,加600μL PBS悬浮细胞,加入6μL RNaseA (10 mg/mL) ,置37 °C培养30 min。检测前加2滴P I,混匀,上机检测。

1. 5　常规Giemsa染色和DAP I荧光染色检测细胞凋亡试验当天,细胞用胰酶消化、用Hank’s液将细胞清洗、离心,胎盘兰染色,镜下计数活细胞数,用1640 培养液+10 胎牛血清调细胞浓度为1 ×106 /mL。将细胞接种于24孔培养板中,每孔加细胞悬液1 mL,共7个组( 2块板) , G2

Rh2 浓度分别为0, 20, 40, 60, 80, 100 μg/mL,置37 °C, 5CO2 培养箱中分别培养24 h和48 h。将细胞取出放入离心管中,用PBS洗2次;用1 mL 37 °C预热的0. 075 mmol/L氯

化钾低渗10 min, 加1 mL 固定液, 离心、去上清, 保留0. 3 mL,将1滴细胞悬液滴在预先洗干净的玻片上。用DA2P I染液进行染色,在Nikon荧光显微镜下观察,用App liedImage数字化图像分析系统进行显微摄影、图像合成。用Gi2emsa染液染色,在普通光学显微镜下观察分析,用Kodak400进行拍照,冲洗照片。

1. 6　TNFa、M IP21α的检测,按照试剂盒说明书进行

2　统计学分析

两均数比较经方差齐性检验后,方差齐者用t检验,方差不齐者用t′检验。

3　结果

3. 1　G2Rh2 抑制了SP2 /O细胞增殖,呈现剂量依赖性G2Rh2 作用72 h后, 10μg/mL组对细胞的增殖已产生抑制作用,抑制率达25. 86 ,以后随着浓度增加,其抑制细胞增殖的作用增强。在G2Rh2 浓度为90 μg/mL 时最明

显,抑制率达35. 26 ,见表1。

表1　不同浓度G2Rh2 对SP2 /O细胞的增殖

抑制作用( x ±s, n = 3)

G2Rh2 (μg/mL) A570 nm 抑制率( )

0 0. 607 ±0. 048

10 0. 450 ±0. 000 25. 86

20 0. 460 ±0. 009 24. 21

40 0. 433 ±0. 025 28. 23

60 0. 420 ±0. 048 30. 81

90 0. 393 ±0. 005 35. 26

120 0. 413 ±0. 045 31. 96

P < 0. 05,P < 0. 001,与0μg/mL组比较。

3. 2　G2Rh2 对SP2 /O细胞凋亡率的影响

药物处理24, 48 h后收集各组细胞,用流式细胞仪检测细胞凋亡率。发现随着G2Rh2 浓度增加细胞凋亡率有逐渐增加的趋势,作用24 h后, 20 μg/mL 组的细胞凋亡率较0μg/mL组无明显变化( P > 0. 05) ,其余各浓度组凋亡率明显增加( P < 0. 05) 。而G2Rh2 作用48 h后,其余各浓度组细胞凋亡率与0μg/mL 组比较均明显增加( P < 0. 05) 。而100μg/mL浓度组,作用24 h及48 h后,同80μg/mL浓度组相比,细胞凋亡率下降,见表2。

表2　G2Rh2 对SP2 /O细胞凋亡率的影响( x ±s, n = 3)

G2Rh2 凋亡率( )

(μg/mL) 24 h 48 h

0 2. 35 ±0. 17 6. 95 ±0. 45

20 2. 57 ±1. 25 8. 12 ±0. 95

40 9. 57 ±1. 21 13. 6 ±3. 12

60 10. 37 ±2. 26 19. 69 ±2. 41

80 15. 87 ±3. 47 17. 19 ±1. 96

100 3 3. 58 ±0. 58 8. 75 ±0. 89

P > 0. 05,P < 0. 05,与0μg/mL组比较。

3. 3　G2Rh2 对SP2 /O细胞周期的影响

药物处理24、48 h后收集各组细胞,用流式细胞仪检测各期细胞数,发现其余各浓度组与0μg/mL组比较, G0 /G1、G2 /M期细胞数目减少, S期细胞数目明显增加( P < 0. 05) ,

3. 4　G2Rh2 作用后SP2 /O细胞形态学改变

3. 4. 1　光镜观察: G2Rh2 作用24 h后, SP2 /O细胞出现染色质浓缩、空泡化;染色质高度凝聚、边缘化,有的呈新月状;细胞核固缩、核碎裂、凋亡小体等细胞凋亡的形态学改变。对

照组细胞则形态完整,核物质分布均匀,细胞不表现出凋亡的形态学改变。

3. 4. 2　荧光显微镜观察: G2Rh2 作用24 h后, SP2 /O细胞膜出现荧光标记,细胞核呈拆缝样、染色质浓缩、空泡及边缘化改变。有的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。正常细胞无荧光标记。

3. 5　G2Rh2 不影响SP2 /O细胞TNFα、M IP21α的产生G2Rh2 各浓度组与0μg/mL组相比,吸光度A570无明显差异( P > 0. 05) ,表明G2Rh2 不影响SP2 /O细胞TNFα、M IP2

1α的产生。

4　讨论

人参皂苷Rh2 对多种细胞有增殖抑制作用,本实验应用MTT法证实G2Rh2 对骨髓瘤SP2 /O细胞抗增殖作用具有剂量依赖性。同时发现, G2Rh2 作用24 h后SP2 /O细胞出现了凋亡的形态学和生物化学变化,流式细胞术检测到SP2 /O细胞的凋亡峰,证明了G2Rh2 具有促进SP2 /O细胞凋亡的作用。我们利用流式细胞术对SP2 /O细胞的凋亡率进行了测定。发现, G2Rh2 作用后,从40μg/mL 至80μg/mL 各浓度组,于24、48 h后细胞凋亡率与0μg/mL组比较,具有明显增加(P < 0. 05) ,表现出时间、剂量依赖性。而20μg/mL组在24 h,凋亡率无明显变化( P > 0. 05) ,在48 h明显增加( P <0. 05) ,说明G2Rh2 在小剂量、短时间内诱导SP2 /O细胞凋亡的作用不明显。樊光华[ 5 ]等报道G2Rh2 作用48 h后,在较低浓度时( 40 μg/mL )肝癌细胞Bel27404 凋亡率可达39.

6 。可见, G2Rh2 对于不同肿瘤细胞诱导凋亡的作用强度不同。结果同时显示, G2Rh2 作用24、48 h后, SP2 /O 细胞G02G1、G22M期细胞明显减少, S期细胞明显增加,说明细胞

周期阻滞于S期,阻断S期细胞向G2 /M期移行,从而抑制了细胞增殖。在MM 发病机理中, TNFα 通过黏附分子ICAM21、VCAM214 的表达,增强MM细胞与基质细胞结合,促进IL26的转录和分泌,从而促进MM 细胞增殖、抑制MM 细胞凋亡[ 6, 7 ]。M IP21α与其受体结合后,通过激活有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK) 、磷脂酰肌醇32激酶( P I32K) /蛋白激酶B(AKT)两条途径发挥其促增殖、抗凋亡的作用,通过特异抗体阻断这两条通路,可显著减少MM小鼠模型体内的肿瘤负荷[ 8, 9 ]。本研究发现G2Rh2 作用24、48 h后, SP2 /O细胞上清液中TNFα、M IP2α的水平未发生变化,说明其抑制增殖、促进凋亡的作用为非依赖TNFα、M IP21α途径,其确切机制尚需进一步研究。

参考文献:

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[ 5 ] 　樊光华,姜　浩,欧文胜. 人参皂苷2Rh2 诱导人肝癌Bel27404细胞凋亡的作用[ J ]. 实用癌症杂志, 2003, 18 (1) : 16218.

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