HIF与胃癌细胞增殖凋亡的关系

　　资料显示，实质性肿瘤发生过程中，由于血管生长的相对滞后和肿瘤细胞的快速增殖导致肿瘤细胞缺氧。缺氧是实质性肿瘤微环境的基本特征之一。缺氧诱导因子（hypoxia?inducible factor,HIF?1）是在缺氧条件下广泛存在于人和哺乳动物体内的一种转录因子。由HIF?1α 和HIF?1β亚单位组成，HIF?1α是HIF?1特有的受缺氧调控的亚基，决定HIF?1的活性。HIF?1α是迄今为止发现的唯一一个特异性缺氧状态下发挥活性的转录因子。近年来，随着对HIF?1α研究的进一步深入，发现它广泛存在于动物和人类的多种肿瘤细胞中，其活性对维持肿瘤细胞能量代谢、新生血管形成、促进肿瘤侵袭和转移起重要作用。探讨HIF?1α同缺氧条件下肿瘤细胞凋亡、增殖的关系，了解其在肿瘤细胞凋亡、增殖的作用。对于研究HIF?1α在肿瘤发生、发展中的作用及探索以HIF?1α为靶点的抗肿瘤治疗有重要意义。本研究通过对人胃癌细胞SGC?7901中HIF?1α的表达及其同缺氧时Fas、PCNA表达的检测，探讨HIF?1α在胃癌发生、发展中可能的作用。

　1 材料及方法

　1.1 材料

　人胃癌细胞株SGC?7901，重庆医科大学病理生理教研室提供。兔抗人Fas多克隆抗体（工作浓度1∶200），免疫组化试剂盒，购于北京中山生物技术有限公司。鼠抗人PCNA多抗（工作浓度1∶400）购于武汉博士德生物工程公司。鼠抗HIF?1α单抗（工作浓度1∶25），购于晶美生物工程公司。

　1.2 方法

　1.2.1 微缺氧条件的制造

　运用产气袋法(GaaK)制造微缺氧条件。通过血气分析仪监测含小牛血清的RPMI1640培养液中PO2、PCO2和pH的变化，本装置在48h内PO2、PCO2和pH稳定，并能达到微缺氧细胞培养的条件（1%～5%氧、5%CO2及90%氮）。

　1.2.2 不同氧状态下细胞爬片的制备

　取对数生长期的SGC?7901细胞，用含10%小牛血清RPMI1640培养液，配成浓度为5×104 /ml的细胞悬液。并分为对照组、缺氧4h组、缺氧8h组、缺氧16h组。各取细胞悬液2ml/孔分别接种于装有盖玻片的6孔培养板内。对照组入CO2培养箱（20%氧、5%CO2、75%氮、37℃）中培养72h，缺氧4h组、缺氧8h组、缺氧16h组。分别入CO2培养箱培养68、64、56h后，再入微缺氧装置内继续培养4、8、16h。

　1.2.3 免疫组化法检测HIF?1α、Fas、PCNA

　取出6孔板内已爬满细胞的盖玻片，洗涤，4%多聚甲醛固定, 0.3%H2O2/甲醇作用30min, 正常羊血清阻断30min, 分别给缺氧组和对照组依次加入稀释的一抗HIF?1α、Fas、PCNA，4℃孵育过夜,生物素化二抗和辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素依次处理(37℃,孵育30min), 期间均用洗涤, AEC显色, 水溶性封片剂封片。每次染色时均以代替一抗作为阴性对照。

　1.2.4 判断标准

　排除爬片边沿细胞，10×10低倍镜下随机选取10个细胞分布均匀的视野，10×20中倍镜下随机计数50个细胞／每视野。按着色强弱分4个等级，按公式HSCORE＝∑Ｐi(i+1)(i=0、1、2、3i表示评分为i的比例) 计算HSCORE得分。

　1.3 统计学处理

　所有数据均用±s表示，采用F检验及q检验分析，数据均用统计软件包SAS8.0分析。用earman等级相关分析HIF?1α同SGC?7901细胞PCNA、Fas的相互关系。

　2 结果

　2.1 不同氧状态下人胃癌细胞株SGC?7901 HIF?1α、Fas 、PCNA的表达

　常规培养条件下SGC?7901细胞仅个别细胞有HIF?1α阳性表达，低氧处理4h后HIF?1α出现阳性表达，并随低氧处理时间的延长逐渐增加（rs=0.935），见图1。常规培养条件下Fas、PCNA均在SGC?7901细胞有阳性表达，低氧处理4h后Fas表达增加，但随低氧处理时间的延长，Fas表达所有下降（rs=-0.972），见图2、3。PCNA在不同氧状态下的表达无明显差异，见表1。表1 不同氧状态下HIF?1α、Fas 和PCNA在SGC?7901细胞的表达常规培养条件下由于HIF?1α在SGC?7901细胞低表达，无法判断其同Fas及PCNA的关系。缺氧条件下SGC?7901细胞HIF?1α表达同Fas表达呈负相关（rs=-0.961,lt;0.05），同PCNA表达无关（rs=-0.632,gt;0.05）。

　3 讨论

　3.1 HIF?1α在不同氧状态下人胃癌细胞株SGC?7901的表达

　Zhong 等对包括胃癌、胰腺癌等癌组织标本及人体正常组织分析发现，大多数人体正常组织中没有或仅有弱阳性的HIF?1表达，而癌组织中HIF?1呈过度表达。体外实验也证实HIF?1α在多种肿瘤细胞株缺氧时呈阳性表达[8，9]，本研究发现SGC?7901细胞在常氧下仅个别细胞HIF?1α呈阳性表达，阳性表达部位在胞核, 阳性率仅在1%～3%。可以认为在常氧下SGC?7901细胞不表达HIF?1α，在低氧处理后，HIF?1α表达明显上调。可能同缺氧阻止了HIF?1α的降解，使在非缺氧时易降解的HIF?1α蛋白稳定性增加。HIF?1α蛋白水平呈指数增加有关[10，11]。本研究还发现HIF?1α表达随缺氧时间的延长逐渐增加，是否同SGC?7901细胞逐渐适应缺氧有关，尚待进一步研究。

　3.2 缺氧状态下SGC?7901细胞HIF?1α的表达同细胞凋亡的关系

　缺氧能诱导肿瘤细胞凋亡，己在实验研究中得到证实。但缺氧时HIF?1α的表达同细胞凋亡的关系尚存有争议。Akakura等在胰腺癌的研究中发现HIF?1α高表达的胰腺癌细胞比无HIF?1α表达的更能抵抗缺氧和无糖所诱导的凋亡。HIF?1α高表达可以明显地增加bcl?2的表达，而在樊利芳等[12]研究中显示，HIF?1α表达同bcl?2的表达呈负相关，表明HIF?1α促进缺氧环境下肿瘤细胞凋亡。本实验中我们发现，在缺氧环境下SGC?7901细胞HIF?1α表达明显上调，同参与细胞凋亡诱导的Fas基因的表达呈负相关，从而使SGC?7901细胞能抵抗缺氧所诱导的凋亡。可能同受HIF?1所调控，参与能量代谢和运输基因及蛋白以不同方式参与肿瘤细胞对缺氧的适应过程有关。

　3.3 缺氧状态下SGC?7901细胞HIF?1α的表达同细胞增殖的关系

　PCNA是DNA聚合酶的辅助因子，参与DNA的合成。已广泛使用于评定肿瘤细胞增殖活性。HIF?1α同肿瘤细胞增殖的关系一直存有争议。Carmeliet等研究表明HIF?1α的缺陷阻止了细胞在缺氧条件下的生长，但在细胞分裂时可刺激其增殖。Horiuchi等[13]发现缺氧时卵巢癌细胞株的细胞数目不减少，同HIF?1α表达增加从而增加了p27的表达和降低cyclinD1及cyclinRB表达有关。Zhong等发现在前列腺癌组织及乳腺癌组织中，HIF?1α表达与Ki67指数相关。Volm等研究小细胞肺癌时HIF?1α与cyclinA表达和细胞周期的关系，发现HIF?1α与细胞增殖无关，存在不同的结果可能同研究的肿瘤组织及检测指标不同有关。本实验表明，在缺氧条件下SGC?7901细胞HIF?1α表达同PCNA无关。

　本实验通过对缺氧条件下SGC?7901细胞HIF?1α、Fas及PCNA表达的观察，分析了HIF?1α表达同细胞凋亡及增殖的相关性，结果表明HIF?1α抑制缺氧所诱导的胃癌细胞凋亡而与细胞增殖无关。认识HIF?1α在胃癌发生、发展中的作用，将为胃癌治疗提供新靶点及思路。

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