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抑癌基因PTEN与胃癌发生的关系

2009-07-24 抗癌健康网

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  胃癌的发生涉及癌基因功能增强,抑癌基因突变或功能缺失。作为第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因PTEN(Phohates and Teion homolog deleted on chromosome Ten),在多种肿瘤中存在失活现象,其失活的原因除突变、缺失外,5’CpG岛异常甲基化可能是其失活的第三条途径。本研究采用敏感的甲基化特异性PCR(M)方法检测PTEN基因启动子在四种不同分化程度的胃癌细胞中的甲基化状态,并通过RT?PCR和Western blot法检测该四种细胞中PTEN mRNA水平和蛋白表达,探讨PTEN甲基化改变、表达异常与胃癌的关系,为胃癌的发生机制提供分子生物学依据,以期为胃癌的治疗探索新途径。

  1 材料与方法

  1.1 材料

  1.1.1 细胞系 胃癌细胞HGC?27(未分化),MGC?803,BGC?823(低分化),SGC?7901(中分化)购自上海生命科学研究院。

  1.1.2 主要试剂 Trizol试剂盒,RPMI1640培养基(Gibco公司);胎牛血清(Hyclone公司);亚硫酸氢钠,氢醌,鼠抗人β?actin抗体,硝酸纤维素膜(Sigma公司);Wizard DNA clean up system(Promega公司);?1酶(New England Biola公司);小鼠抗人PTEN抗体,ECL试剂盒(Santa Cruz公司);PTEN甲基化和未甲基化引物及PTEN和β?表1 用于M、RT?PCR各引物序列、产物大小和退火温度注:M两对引物中经亚硫酸氢钠处理后改变的碱基用黑体字标出,甲基化和非甲基化引物序列中碱基的不同用下划线标出ctin引物由上海生工合成。

 1.2 方法

 1.2.1 细胞培养 4种细胞用含10%胎牛血清(56℃灭活30min),100u/ml青霉素和100u/ml链霉素的RPMI?1640培养液(pH7.2),在37℃、5 %的CO2培养箱中培养。

 1.2.2 RT?PCR检测PTEN mRNA水平 Trizol一步法提取细胞总RNA,经逆转录后再以cDNA为摸板扩增。PTEN基因和β?actin的引物序列,见表1。PTEN PCR反应条件:94℃ 3min,以94℃30s,54℃30s,72℃45s循环20次,72℃延伸7min;β?actin PCR反应条件:94℃ 3min,以94℃40s,56℃45s,72 ℃60s循环20次,72 ℃延伸7min。1.5%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统拍照并检测吸光度值,将PTEN与β?actin吸光度比值作为其mRNA水平的相对值。重复实验6次,取均值。

 1.2.3 Western Blot法检测PTEN基因蛋白表达水平 提取细胞总蛋白,Bradford法测蛋白浓度。10%PAGE凝胶电泳,电转,加入一抗二抗,显色。暗室内X光底片感光成像并进行图像分析,计算条带的积分吸光度(IA),将PTEN与β?actin吸光度值的比值作为其蛋白表达的相对值。上述步骤重复6次,取均值。

 1.2.4 DNA的提取、修饰和纯化 用经典的蛋白酶K?苯酚?氯仿法抽提细胞DNA,参照Herman的方法[1],依次采用氢醌及亚硫酸氢钠,Wizard DNA clean up试剂盒修饰,纯化DNA。完全甲基化对照是将正常人外周血淋巴细胞DNA与SAM(终浓度160μM),1×NEBuffer2和1U的?1酶共同37℃孵育2h后再经亚硫酸氢钠修饰;完全未甲基化对照仅用亚硫酸氢钠处理;阴性对照分别用没有经亚硫酸氢钠处理的DNA和H2O代替模板DNA进行PCR。

 1.2.5 M 引物设计根据PTEN基因序列(Geank acceion number AF143312),MethPrimer软件,并参照Salvesen HB,Kang GH,Kang YH等[2?4]合成,见表1。25μl PCR反应总体系为:10×Taq酶Buffer 2.5μl,dNTP 2.0μl(终浓度200μM),Taq酶0.5μl(1u),上下游引物各25pmol,MgCL 1.0μl,模板DNA 2~3μl,补足水至25μl。反应条件为:94℃热启动11min后开始35个循环:94℃40s,63℃45s,72℃1min,最后于72℃延伸12min,4℃保存。产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溴化乙锭染色后在紫外光下观察,凝胶成像系统拍照。

 1.3 统计学分析

 所有数据用±s表示,用11.5软件进行统计学分析,lt;0.05为差异有显著性。

 2 结果

 2.1 PTEN mRNA和蛋白表达水平 见表2。

 mRNA和蛋白水平SGC?7901细胞显著高于HGC?27细胞(t=18.1536,lt;0.01)及MGC?803和BGC?823细胞(t=9.010,lt;0.01;t=7.4567,lt;0.01),后两者显著高于HGC?27细胞(t=9.14,lt;0.01;t=10.697,lt;0.01),但是MGC?803和BGC?823细胞之间蛋白表达水平无明显差异(t=1.5535,gt;0.05)。如图1、2所示。可见随着胃癌细胞分化程度的降低,PTEN mRNA和蛋白表达逐渐减少,两者呈正相关趋势。表2 四种胃癌细胞中PTEN mRNA和 蛋白表达水平

 2.2 PTEN基因启动子区CpG岛的甲基化状态

 HGC?27(未分化)、MGC?803、BGC?823(低分化)细胞,两种引物均有目的片段的扩增,提示了这三种细胞PTEN基因CpG岛发生了部分程度甲基化,SGC?7901(中分化)只有PTEN?U有目的片段的扩增,提示其没有发生甲基化。完全甲基化阳性对照只扩增出206的条带,完全未甲基化阳性对照只扩增出162的条带,阴性对照均无目的条带扩增,见图3。

 3 讨论

 自从抑癌基因PTEN被发现,至今已发现包括胃癌在内的多种肿瘤中都存在着PTEN改变,如子宫内膜癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌[5?8]。肿瘤细胞中导致PTEN基因沉默的原因之一是缺失和突变;导致PTEN沉默的另一原因即是其5’启动子区的CpG岛甲基化。PTEN基因的CpG岛甲基化将导致转录抑制,进而导致其表达产物PTEN蛋白的减少甚至缺失。

 本实验研究了四种胃癌细胞甲基化状态及其mRNA水平和蛋白的表达。HGC?27(未分化)、MGC?803、BGC?823(低分化)细胞PTEN基因启动子区CpG岛可检测到甲基化,SGC?7901(中分化)细胞则未检测到甲基化,且细胞分化程度越低,PTEN mRNA与蛋白表达水平越低。这一结果与Kang等、Kang等的报道一起说明PTEN在人胃癌细胞和组织中均发生了一定程度的甲基化,这可能是引起PTEN mRNA表达减少并导致其蛋白表达减少或缺失的机制之一,但是,Sato等研究却认为PTEN并未发生甲基化。这可能是由于PTEN基因启动子区富含的CpG岛并未全部发生甲基化,在进行PCR扩增中所设计的引物并未能针对已发生甲基化的区域扩增。另外,不同细胞株(即使是同一细胞株的不同细胞)来的DNA甲基化程度可能不一样,这都是导致结论不一的原因。另外我们发现,PTEN mRNA和蛋白表达水平与细胞分化程度呈正相关趋势。一般来说,细胞分化程度越低,其恶性程度就越高,病人预后越差。

 此实验通过对PTEN基因表达和甲基化状态的研究,为胃癌的发生机制提供了分子生物学依据,也为肿瘤的治疗提供了新的思路。但该结果仅从DNA、RNA和蛋白水平分析PTEN在胃癌发生发展中的异常改变,其参与肿瘤发生发展的机制还有待于进一步研究。

(编辑:刘辉)

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