生长抑素基因与胃癌发生的关系

　　RNA干扰（RNA interference, RNAi)是双链RNA（dsRNA）介导的序列特异性转录后同源靶基因沉默效应。由于小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）在哺乳动物细胞中可以诱导RNAi 效应，它已经成为基因功能研究的重要工具。胃癌的发病机制十分复杂，其病因目前尚未阐明，胃肠激素在胃癌发生、发展的过程中所起的作用正日益受到关注。本研究设计并体外合成了短双链RNA，通过转染胃癌细胞系BGC?823，研究其干扰生长抑素（somatostatin, SOM）基因表达的效应，为筛选抑制SOM基因表达的有效序列，进一步研究其功能奠定了基础。

　1 材料与方法

　1．1 材料 胃癌细胞系BGC?823, 由本教研室保存，胎牛血清，胰蛋白酶购自Takara，T7RiboMAXTM Expre RNAi System购自Promega公司, CodeBreakerTM siRNA Trafection Reagent购自Promega公司。TRIZOL Reagent RNA提取试剂盒，购自invitrogen. RT?PCR两步法试剂盒购自上海生物工程公司。PUC19DNA Marker购自上海生物工程公司。

　1.2 方法

　1.2．1 靶向SOM的siRNA设计 在Geank中取得SOM基因全长mRNA序列，用Sira mode of Sfdd 软件（http:/sfdd.ward worch.org/sirna.pl）,进行siRNA的设计及RNA二级结构的预测。SOM基因全长cDNA共633个碱基，根据分析结果选择220～240为靶序列, TGATGCCCTGGAACCTGAA。

　1.2．2 siRNA模板寡核苷酸的设计 依据所设计的靶向siRNA序列，根据试剂盒的要求设计siRNA 模板寡核苷酸，由上海生物工程公司合成。

　1．2．3 β?actin基因内参照引物的设计与合成 根据Geank上发表的看家基因β?actin的序列，利用Primer premier 5.0软件设计了β?actin的序列，扩增长度为198。

1.2.4 SOM基因RT?PCR扩增引物的设计 根据GeneBank上发表的SOM基因的序列（acceion no. BC032625）利用Primer premier5.0软件设计了RT?PCR的序列，扩增长度为356。

1.2.5 合成siRNA用T7RiboMAXTM Expre RNAi System 试剂，按照试剂盒说明书以合成的寡核苷酸为模板，体外合成siRNA。

　1.2.6 转染 37℃,5% CO2,10%胎牛血清常规培养胃癌细胞系BGC?823，CodeBreakerTM siRNA Trafection Reagent转染BGC?823。转染前6孔板接种3孔，24孔板接种3孔，分别设对照组和转染实验组，待细胞长到50%～70%，进行转染。24孔板转染时，准备2个500μl离心管，每管加入2μl转染试剂与125μl无血清培养基充分涡旋混合，室温孵育20min，空转染对照组不加siRNA，实验组加入双链siRNA 0.1μl到稀释的转染试剂，使siRNA转染浓度达到10nM，轻轻用手指弹匀，室温孵育20min，分别加入6孔板中的两个孔中，加10%胎牛血清培养基2.5ml、37℃、5% CO2，培养24h后收集细胞。6孔板转染时，准备两个1.5ml离心管，每管加入10μl转染试剂与625μl无血清培养基充分涡旋混合，室温孵育20min，空转染对照组不加siRNA，实验组加入双链siRNA 0.5μl到稀释的转染试剂，使siRNA转染浓度达到10nM，轻轻用手指弹匀，室温孵育20min，加入6孔板中的两个孔中，加10%胎牛血清培养基2.5ml、 37℃、5% CO2,培养24h后收集细胞。

　1.2.7 免疫组化检测抑制效应 转染后24h，收集24孔板培养的两组细胞，做细胞涂片，4%多聚甲醛固定，按照试剂盒要求做免疫组化,DAB显色。

　1.2.8 RT?PCR检测抑制效应 转染后24h，收集6孔板培养的两组细胞， 每孔加1ml TRIZOL 试剂，按试剂盒操作说明，分别提取总RNA, 电泳鉴定， 按照RT?PCR试剂盒两步法说明书操作，分别用SOM基因和β?actin基因引物， 进行RT?PCR。

　2 结果

　　siRNA对SOM基因的抑制作用 取RT?PCR产物5μl，1.5%琼脂糖凝胶电泳，结果可以看出两组样品在198处均可见到β?actin，转染组在356处条带较弱，说明SOM基因表达受到抑制，而正常对照组在356处条带较亮，说明扩增出了靶基因。

　肿瘤的发生是多基因参与的过程。以往对肿瘤的研究多仅限于探讨某几种癌基因或抑癌基因在肿瘤中的表达，无法深入提示肿瘤发生的内在机制。寻求一种新的有效方法深入对该基因进行功能研究是了解肿瘤发生发展过程的重要策略。目前对基因功能的研究最有效的方法有两种：一是观察该基因突变的表型改变，这类改变可通过同源重组的方式直接诱导产生，也可经研究某随机突变生物体中该基因损害而得到认识；另一种是利用反义核酸技术特异性抑制该基因的表达，从而研究该基因的功能，但反义技术存在特异性不强、效率不高等缺点。自1998年以来，RNAi技术已成功应用于线虫、果蝇、斑马鱼、真菌、植物以及哺乳动物等生物的基因功能研究，并且应用范围不断拓宽，它的出现为基因功能研究提供了一种新的具有高效性和高度特异性的功能基因组研究策略。

　SOM是1973年Brazeau等从羊下丘脑中分离并提纯的一种调节肽，对机体几乎所有的生理性内分泌反应均起抑制作用，其对肿瘤的作用目前尚无定论[3]。SOM的作用是通过膜上生长抑素受体（TR)结合起作用。TR具有识别不同化学信使的能力，并能通过一些直接或间接的偶联系统启动生物反应，但具体的信号转导途径不详。尽管大量文献报道SOM抗肿瘤作用机制，但看法不尽一致。Lahlou等认为通过Ras?, Rap1?, and B?Raf?ERK2激活有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPK)抑制细胞的增殖。Liang等、Charlands等报道SOM可以抑制肿瘤细胞Akt磷酸化和细胞周期启动。Hu等研究发现SOM类似物可诱导抑制瘤细胞凋亡，同时伴随着肿瘤内增高的去磷酸化状态。因此，采用RNA干扰技术研究SOM的功能，探讨其与肿瘤发生的关系具有重要意义。RNA干扰成功的关键是siRNA作用靶序列的选择。本实验设计并体外合成针对第220～240靶序列的siRNA能有效抑制SOM的表达。Tuschl等研究发现应避免选择5’和3’ URT，避免选择启动子起始部位下游50～100nt内的区域或终止子上游50～100nt内的区域。选择以两个AA开始的序列，这将使合成siRNA更加容易、更加经济和创建一个对核酸酶更有抵抗力的siRNA。选择GC含量在35%～50%之间的mRNA区域。本实验选用的靶序列GC含量为47.6%。避免超过3个G或3个C重叠。多聚G或多聚C序列能产生堆积形成类聚物而干扰siRNA沉默效应。通过BLAST查询是否具有同源性，保证靶序列，与其他基因没有同源性，以避免产生同一序列的基因干扰。本实验设计并合成的siRNA能有效抑制SOM基因的表达。建立了SOM表达抑制的细胞系为下一步深入研究SOM基因在胃癌发生、发展中的作用机制奠定了基础。

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