丙型肝炎导致肝癌机制研究

　　丙型肝炎为全球流行性传染性疾病，据估计全球丙型肝炎病毒（HCV）感染者超过1亿人。原发性肝癌（HCC）是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤，且发病率呈逐年上升趋势，HCV与HCC关系密切，但HCV致肝癌的机制至今仍未明了，HCV是一种RNA病毒，无逆转录酶活性，也不与宿主基因整合，并且其本身没有一个可知的癌基因。其致癌作用可能与细胞凋亡受抑，癌基因及抑癌基因的突变及表达量的异常，细胞信号传导异常等有关。c?myc和ras为重要的原癌基因，大量的研究发现，c?myc和ras在HCV相关肝癌中起重要作用。迄今为止，HCV 4B的功能尚不明确，HCV 4B是否可影响相关癌基因与抑癌基因的表达,国内外未有相关文献报道。本研究利用脂质体介导技术将外源性基因4B导入正常肝细胞内，并G418筛选稳定传代，将c?myc和ras作为检测指标，探讨HCV 4B可能的致癌作用。

　1材料和方法

　1.1 材料

　1.1.1细胞与质粒

　Chang肝细胞株，由四川大学华西医学中心王修杰教授惠赠;空白载体PCXN2及PCXN2?4B质粒，李昌平教授构建并保存。

　1.1.2试剂

　培养基RPMI1640（Gibco公司），小牛血清（成都哈里生物公司），TritonX?100,G418（上海Sangon公司），脂质体转染试剂Doer(德国Roche公司)，Trizol RNA提取试剂（Gibco美国）,RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit (MBI)，ras多克隆抗体（Neomarker公司），c?myc抗体（Boster公司），超敏试剂盒（福州迈新生物技术有限公司）。

　1.2方法

　1.2.1细胞培养

　用RPMI1640(含10%小牛血清)将Chang肝细胞培养于37℃,5%CO2孵箱中,每2～3d换液一次。

　1.2.2基因转染及筛选

　取对数生长期细胞,转染前一天消化以3×105/ml接种于6孔板中,置于37℃、5%CO2孵箱中培养,待细胞生长达70%融合,将肝细胞分为3组,空白对照组（未转染的Chang肝细胞）、空白载体组（PCXN2转染组），PCXN2?4B转染组，每组设两个复孔，转染前以无血清培养基洗细胞3次，以1.5μg/6μg配制质粒/脂质体混合物，轻柔混合后室温下静置15min，将混合物逐滴加入相应各孔，空白对照组加入等体积无血清培养基，6h后更换转染培养基，加入完全培养基继续培养，24h后加入G418（1 000mg/L）筛选，待对照组细胞全部死亡后，G418 减量为200 mg/L维持筛选并传代培养。

　1.2.3RT?PCR转染细胞鉴定

　细胞生长足量时，Trizol试剂分别提取PCXN2组及PCXN2?4B组总RNA，逆转录合成cDNA，按试剂盒说明书建立反应体系，取RT?PCR产物10μl行琼脂糖电泳。

　1.2.4免疫细胞化学方法检测c?myc及ras蛋白的表达

　将空白对照组、PCXN2组及PCXN2?4B组细胞分别消化接种于经多聚赖氨酸处理的盖玻片上,置于37℃、5%CO2孵箱中培养24h,洗细胞3次,10%中性甲醛固定细胞30min,0.3% TritonX?100通透细胞30min,过氧化物酶阻断剂孵育10min,非免疫性动物血清中孵育10min,加一抗4℃冰箱过夜后,生物素标记的二抗中孵育10min,加复合物孵育10min,DAB显色,苏木素复染,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,显微镜下观察，照相。以代替一抗作阴性对照。每组细胞各进行了10次独立性实验。

　1.3统计学处理

　数据用±s表示。比较采用单因素方差分析，以lt;0.05差异有显著性，利用 10.0软件进行统计分析。

　2结果

　2.1细胞转染及筛选结果

　用G418对各实验组的细胞进行筛选，结果显示：G418 1000mg/L筛选48h后，细胞开始脱壁漂浮，第6d转染组细胞出现新分裂增殖的细胞，第10d形成新生细胞克隆，呈集落状，第15d对照组细胞全部死亡，G418减量为200mg/L维持筛选，继续培养传代。

　2.2RT?PCR抗性转染细胞的鉴定

　提取细胞总RNA，RT?PCR扩增，可见PCXN2组及PCXN2?4B细胞有mRNA表达，表明外源基因导入Chang细胞后，有稳定表达。

2.3免疫细胞化学方法检测c?myc和ras蛋白水平的变化

　以细胞质或核内棕黄色着色为阳性结果，不着色为阴性，细胞计数以低倍视野100个细胞，共5个视野的阳性细胞，取其均值为阳性细胞数作统计处理。c?myc蛋白在胞浆和胞核均有表达。空白对照组及空白载体组无c?myc表达，转染4B组c?myc表达率为(21.3±1.2)%，lt;0.01，与空白对照组及空白载体组比较差异有显著性；ras蛋白主要在胞浆及核周表达。ras空白对照组表达率为(1.2±0.5)%,空白载体组表达率为(1.3±0.2)%，转染4B组ras表达率为(52.6±2.4)%,与前两组比较差异均有显著性，lt;0.01。

　3讨论

　丙型肝炎病毒4B是疏水的27KD蛋白。目前相关研究认为4B是HCV复制复合体的一部分，并且4B可能在HCV致病机制中发挥重要作用。4A/4B的蛋白前体可显著影响宿主对HCV感染的免疫反应[1]。Kato等[2]发现4B可激活NF?κB相关信号,而NF?κB可对抗TNF?α诱导的细胞凋亡，提示4B可能可诱导细胞内的生存信号。Florese等报道了4A和4B在翻译水平至少可部分抑制细胞内蛋白合成如RNase L、p53，其抑制宿主细胞翻译的机制可能有助于HCV在宿主细胞的生存与感染。本实验通过G418筛选，得到了HCV 4B在正常肝细胞的稳定表达系统，观察了其对细胞内蛋白c?myc和ras表达的影响。

　　c?myc是myc癌基因家族中最重要的一员，编码一种细胞核内的DNA结合蛋白，myc与不同因素，分别具有调节细胞增殖、分化及凋亡的不同效应。Ray等将编码Ｃ蛋白的cDNA与c?myc共转染猴COS细胞，发现C蛋白呈现剂量依赖性激活c?myc基因的启动子活性。也有其他一些研究发现HCV核心蛋白可诱导c?myc表达。本实验发现在HCV 4B转染的正常肝细胞中c?myc蛋白呈现高水平的表达，而空白对照组及空白载体组未检测到c?myc的表达，这提示4B可能诱导c?myc在蛋白水平的表达。myc过度表达可改变细胞内周期调控，使细胞易于转变为恶性表型，与其他基因协同发挥作用可促使细胞的“永生化”，加速细胞增殖，引发肿瘤。

　　Park JS等报道协同表达4B和H?ras基因的NIHT3细胞显示接触抑制的丧失、形态学上改变及锚着非依赖性生长，提示HCV 4B和H?ras共同作用在HCV感染细胞的恶性转变中起重要作用。本实验同时观察了HCV 4B对癌基因ras蛋白表达的影响。实验结果显示，转染了4B的肝细胞组ras蛋白表达率明显高于对照组，显示4B可促进ras蛋白的表达。ras癌基因家族的蛋白产物能通过和GTP或GDP的结合来调节细胞的生长和分化，其表达异常与肝癌细胞的增殖有关。

　　在实验性肝癌模型中，发现肝变异细胞、增生性病变以及肝细胞癌中，均可检测到c?myc及ras的表达增加，且有随病变进展而增加的趋势，c?myc和ras可能具有协同作用，促进细胞增殖而形成肝癌[7]。本研究显示HCV 4B可诱导或促进c?myc及ras蛋白的表达。因此，推测HCV 4B有可能通过影响c?myc和ras蛋白的表达，在促进肝细胞增生和恶性转化中发挥重要作用。肝细胞的癌变是一个多因素参与的多阶段发展过程，HCV 4B究竟只是在某个阶段，或者是全过程参与肝细胞转化仍不清楚，另外，其影响癌基因表达后的进一步作用机制仍有待进一步的研究。

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