膀胱癌患者外周血树突状细胞的体外培养、鉴定及其诱导的抗肿瘤效应

【关键词】 膀胱癌

【摘要】 目的 体外观察膀胱癌患者树突状细胞（dendritic cells，DC）增殖、成熟，刺激淋巴细胞的增殖;树突状细胞诱导的特异性细胞毒性T细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）对膀胱移行细胞癌T-24的杀伤效应。 方法 膀胱癌患者外周血中分离出单个核细胞（MC），用含有细胞因子粒/巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）1000U/ml、白细胞介素-4（rhIL-4）500U/ml、肿瘤坏死因子（TNF）-α100U/ml、肿瘤相关抗原（TAA）培养细胞，观察树突状细胞的生长状况，流式细胞仪检测DC表型（CD1a、CD80、CD86、HLA-DR）。DC诱导的自体淋巴细胞的增殖和CTL对膀胱移行细胞癌T-24的杀伤效应用MTT法检测。 结果 从外周血中分离得到的单个核细胞，经体外rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-α、TAA共同诱导培养，得到大量成熟DC。形态学观察可见典型DC特征;流式细胞仪检测DC高表达CD1a、CD80、CD86、HLA-DR分别为60.4%、60.4%、87.5%、98%。同种混合淋巴细胞反应显示DC刺激同种淋巴细胞增殖的增殖率为0.74±0.06;CTL对膀胱癌T-24杀伤率为0.54±0.03。 结论 体外多种细胞因子和肿瘤相关抗原能有效地引起膀胱癌患者淋巴细胞的增殖及DC的成熟，DC特异性CTL能有效地杀伤膀胱移行细胞癌T-24。

【关键词】 树突状细胞 体外培养 膀胱癌 免疫治疗

Identification and antitumour of dendritic cells from peripherial blood of bladder cancer patients

Guo Tao，Wang Zhiping，Duan Jianmin

Ititute of Urology，2nd Affiliated Hoital of Lanzhou Medical College，Lanzhou730030.

【Atract】 Objective To culture and proliferate dendritic cells from the peripheral blood of bladder cancer patients.To oerve the morphologic，phenotypic and the effects of cytotoxic T lymphocytes on killing bladder cancer cell line T-24.Methods Dendritic cells were obtained from peripheral blood mononuclear cells（MC）in the pa-tients with bladder cancer.The DCs were cultured in the presence of granulocyte/macrophage colony stimulating factor（1000U/ml），interleukin-4（500U/ml），tumor necrosis factor-α（100U/ml）and extracted tumor-aociated antigen（TAA）from human bladder cancer cell line T-24.The phenotypes（CD1a、CD80、CD86、HLA-DR）were determined by Flow Cytometer Coulter Epics XL.The proliferation of lymphocytes induced by DC and cytotoxicity of CTL were aayed byMTT aay.Results In vivo cytokines and tumor antige could effectively result in the DC am-plification and high expreion of CD1a（60.4%）、CD80（60.4%）、CD86（87.5%）、HLA-DR（98%）.The lympho-cytes induced by DC can results in agait bladder cancer cell line T-24.Conclusion Large amount of mature DCs could be generated by human peripheral blood monocytes with the cytokines in vivo.The lymphocytes were induced by DC results effectively in agait bladder cancer cell line T-24.

【Key words】 dendritic cell culture in vitro bladder cancer immunotherapy

本研究旨在观察膀胱癌患者树突状细胞体外培养及对自体淋巴细胞的增殖作用、树突状细胞所诱导的细胞毒性T细胞对膀胱移行细胞癌T-24的杀伤效应，为膀胱肿瘤的免疫治疗提供有效的帮助。

1 材料与方法

1.1 材料来源 外周血采自兰州医学院第二附属医院泌尿外科住院膀胱癌患者;膀胱移行细胞癌株T-24购自中科院上海生化细胞所细胞库;淋巴细胞分离液购自AXIS-SHIELD POC AS，Oslo，Norway，粒/巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素-4、肿瘤坏死因子-α（Peproteche，英国），RPMI1640培养基购自GIBCO公司，MTT购自AMRESCO公司。抗CD1a、CD80、CD86、HLA-DR分别购自美国eBio-science、CALTAG公司，流式细胞仪（美国，FLOW CYTOME-TER COULTER EPICS XL）。

1.2 实验方法

1.2.1 外周血单个核细胞的分离 病理证实的膀胱癌患者外周静脉血10ml，淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，用含有10%F的RPMI1640液悬浮细胞，置培养瓶中37℃、5%CO 2 孵育箱内孵育2h，即获得贴壁细胞。

1.2.2 树突状细胞的培养 培养终止后弃去上清，Hank‘s液轻轻洗一遍，剩余贴壁细胞用含有多种细胞因子rhGM-CSF1000U/ml、rhIL-4500U/ml10%F的RPMI1640液培养。采用离心法换液，用吸管吹起培养瓶内细胞，置离心管中离心1500r/min5min。弃去上清液，细胞用含有多种细胞因子的培养液继续培养，每3天换液1次，第3天加入TAA，第7天加入rhTNF-α100U/ml，换液时追加TAA和rhTNF-α。DC培养9天后进行流式细胞仪的鉴定。

1.2.3 TAA的制备 培养膀胱移行细胞癌T-24，收集对数生长期细胞，T-24细胞用Hank‘s液洗涤两遍，然后用10%F的RPMI1640液吹匀，-80℃冰箱置30min，37℃放置10min，反复冻融3次，镜检无细胞，细胞培养无细胞生长，即得肿瘤相关抗原（TAA），制备的TAA用0.2μm滤器过滤后置-80℃冰箱保存备用。

1.2.4 制备TAA特异性的DC 于DC培养第3天加入TAA，按TAA DC=3∶1的比例，于含有细胞因子的10%F的培养液中37℃、5%CO 2 的孵育箱内培养3天即得。

1.2.5 DC表型检测 培养第9天DC细胞，液洗涤2遍，调整细胞浓度达到10 7 个/ml。分装两离心管。离心1500r/min，5min，分别加入CD1a、CD80、CD86、HLA-DR单抗，同时，放对照管。加DC于各试管中（50～100μL），避光、室温15min，进行流式细胞仪检测。

1.2.6 TAA特异性的DC与淋巴细胞制备CTL 来自同一膀胱癌患者的新鲜外周血，分离出单个核细胞，离心后用含10%F的RPMI1640液悬浮细胞置37℃、5%CO 2 的孵育箱内孵育2h，收集非贴壁细胞即为淋巴细胞。按DC∶LC=1∶50的比例，于DC培养第9天加淋巴细胞、IL-2200U/ml在含有多种细胞因子的RPMI1640完全培养液中37℃、5%CO 2 孵育箱内继续培养3天即得CTL。

1.2.7 DC对自体淋巴细胞的增殖反应 抽取膀胱癌患者外周血5ml，Ficoll法分离单个核细胞（MC），取非贴壁细胞即为效应细胞，以培养10天的DC为刺激细胞，将DC加入含有丝裂霉素C50μg/ml的完全的RPMI1640液，置37℃、5%CO 2 孵箱中培养45min，Hank‘s液洗涤三次，DC按4×10 4 个/孔、2×10 4 个/孔、1×10 4 个/孔、5×10 3 个/孔加入96孔板，设三个复孔，新鲜自体淋巴细胞以2×10 5 个/孔加入96孔板，并设立对照组，终体积为200μl。置37℃、5%CO 2 孵育箱中培养96h，培养终止6h前加入MTT（5mg/ml）工作液20μl，继续培养6h，培养终止后每孔各加入二甲亚砜100μl，避光静置40min，酶标仪测定570nm处吸光度A值。增殖率=（实验组吸光度A值-对照组吸光度A值）/对照组吸光度A值×100%

1.2.8 TAA特异性的DC的CTL对膀胱癌T-24的杀伤作用 取对数生长期的膀胱移行细胞癌T-24，用完全RPMI1640配成浓度为5×10 4 个/ml，按5×10 3 /孔加入96孔板，37℃、5%CO 2 培养24h后，按5 1、10 1、20 1、40 1加入膀胱癌患者TAA特异性DC刺激的CTL，37℃、5%CO 2 培养24h后，用MTT法测定杀伤活性。37℃、5%CO 2 培养24h，培养终止后每孔加入MTT（5mg/ml）工作液20μl，继续培养6h，培养终止后每孔各加入二甲亚砜100μl，避光静置40min，酶标仪测定570nm处吸光度A值。杀伤率=（实验组吸光度A值-对照组吸光度A值）/对照组吸光度A值×100%

1.3 统计学方法 采用8.0统计软件，DC诱导的自体淋巴细胞增殖率以及对膀胱移型细胞癌T-24的杀瘤率以均数±标准差（ˉx±s）表示。

2 结果

2.1 DC的形态学观察 MC在T-25cm 3 培养瓶中37℃、5%CO 2 孵育2h后获得贴壁细胞，用含有细胞因子rhGM-CSF1000U/ml、rhIL-4500U/ml10%F的RPMI1640液培养1天后可见有悬浮细胞增多，细胞变的较大，不规则，并有细胞聚集现象。培养至第7天，可见大量悬浮细胞，细胞成毛刺状，有些细胞聚集成向日葵状，成明显的DC形态。培养第9天DC的形态更加明显、典型。见图1。

图1 第9天成熟DC照片

2.2 DC表面分子检测 经多种细胞因子培养9天的DC，FACS检测显示:DC高表达CD1a、CD80、CD86、HLA-DR分别为60.4%、60.4%、87.5%、98%。

2.3 TAA特异性DC对淋巴细胞的增殖作用 负载TAA的DC对自体淋巴细胞有明显的增殖作用，随浓度梯度的变化而变化。其中，DC∶LC=1∶5时的增殖作用最为明显，增殖0.74±0.06。

表1 DC/LC不同比值时淋巴细胞增殖率（略）

2.4 CTL对膀胱癌T-24的杀伤效应 TAA特异性DC的CTL对膀胱癌T-24细胞有明显的杀伤作用。结果显示在效/靶比为40∶1时杀伤效应最明显为0.54±0.03。

表2 效/靶不同比值时CTL对T-24的杀伤率（略）

3 讨论

DC是目前所知的最有效的抗原递呈细胞，在肿瘤的免疫治疗中具有重要的地位。研究发现，肿瘤组织中DC抗原呈递功能常低下，不能有效地活化体内的特异性CTL，达到抗肿瘤免疫的目的 ［1］ 。本实验结果显示，膀胱癌患者外周血来源的MC在体外经rhGM-CSF、rhIL-4及rhTNF-α共同刺激能产生大量具有高免疫活力的DC，是体外培养DC成熟的方法。GM-CSF的作用可以促进DC的前体细胞形成集落，向DC分化，IL-4的作用在于抑制DC的前体细胞向巨噬细胞分化的潜能。TNF-α则是抑制DC诱导过程中粒细胞的产生，促进DC成熟，增强DC的抗原呈递功能 ［2］ 。肿瘤细胞冻融物中包含有丰富的膜抗原、MHC类抗原表位、多种热休克蛋白（heat shock protein，H）家族分子成分，经过DC的摄取、加工和呈递后，可激发针对多种肿瘤抗原簇的CTL克隆，是制备特异性肿瘤DC疫苗和诱导DC成熟的一种有效的办法 ［3，4］ 。DC的鉴定目前通过形态学以及流式细胞仪为较可靠的方法。膀胱癌患者DC经相关肿瘤抗原（TAA来源于膀胱移行细胞癌T-24）刺激后成为肿瘤疫苗，体外培养成熟的DC对自体淋巴细胞有明显的增殖作用，当DC与淋巴细胞比值为1:5时增殖效应最明显，这一结果说明DC具有很强的刺激淋巴细胞增殖的能力，同时也表明DC具有很强的抗原呈递能力。DC的这种作用是通过分泌IL-12来实现的 ［5］ 。膀胱癌患者DC激活自体淋巴细胞所产生的CTL对膀胱肿瘤细胞T-24的特异性杀伤作用是显著的，当CTL与T-24细胞效靶比为40:1时对膀胱癌细胞的杀伤最明显。DC诱导的CTL除直接杀伤肿瘤细胞外，还通过CTL分泌的多种细胞因子IL-12等而发挥抗肿瘤作用，负载抗原后的DC疫苗在动物模型中的抗瘤效应已得到验证 ［6～8］ 。近年来，对DC的生物学特征及功能有明显的认识，特别是其强大的抗原呈递作用在抗肿瘤免疫中得到了广泛的应用。为进一步研究DC在抗膀胱癌肿瘤免疫中奠定了基础。

参考文献

1 Almand B，Reer JR，Lindman B，et al.Clinical significance of defec-tive dendritic cell differentiation in cancer.Clin Cancer Res，2000，6:1755-1766.

2 Morse MA，Zhou LJ，Tedder TF，et al.Generation of dendritic cells in vitro from peripheral blood mononuclear cells with granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor，interleukin-4，and tumor necrosis factor-alpha for use in cancer immunotherapy.A Surg，1997，226:6-16.

3 Bachleitner-Hofma T，Stift A，Friedl J，et al.Stimulation of autol-ogous antitumor T-cell reoes agait medullary thyroid carcinoma using tumor lysate-pulsed dendritic cells.J Clin Endocrinol Metab，2002，87:1098-1104.

4 Schnurr M，Galambos P，Scholz C，et al.Tumor cell lysate-pulsed human dendritic cells induce a T-cell reoe agait pancreatic car-cinoma cells:an in vitro model for the aement of tumor vaccines.Cancer Res，2001，61:6445-6450.

5 Nishioka Y，Wen H，Mitani K，Roi PD，et al.Dofferential effects of IL-12on the generation of alloreactive CTL mediated by murine and human dendritic cells:a critical role for nitric oxide.J Leukoc Biol，2003，73:621-629.

6 Yamanaka R，Zullo SA，Tanaka R，et al.Enhancement of antitumor immune reoe in glioma models in mice by genetically modified den-dritic cells pulsed with Semliki forest virus-mediated complementary DNA.Jneurosurg，2001，94:474-481.

7 Iug O，Ku G，et al.A dendritic cell vaccine induces protective immu-nity to intracranial growth of glioma.Anticancer Res，2002，22:613-621.

8 Ebtesham M，Kabos P，Gutierrez MA，et al.Intratumoral dendrtic cell vaccination elicits potent tumoricidal immunity agait malignant glioma in rats.J Immunother，2003，26:107-116.

（编辑子 萱）

作者单位:730030甘肃兰州兰州医学院第二附属医院泌尿外科研究所（通讯作者）