膀胱癌患者一氧化氮对外周血树突状细胞的影响

【关键词】 膀胱肿瘤

Effects of nitric oxide on peripheral blood dendritic cells in patients with bladder cancer

　　GUO Tao, WANG ZhiPing, DUAN JianMin

　　Ititute of Urology, Second Hoital, Lanzhou Medical College, Lanzhou 730030，China

　　【Atract】 AIM: To investigate the effects of nitric oxide (NO) on peripheral blood dendritic cells (DCs) in patients with bladder cancer. METHODS: DCs were obtained from peripheral blood mononuclear cells (MC) in patients with bladder cancer. The DCs were cultured in the presence of granulocyte/macrophage colony stimulating factor (1×106 U/L), interleukin4 (5×105 U/L), tumor necrosis factorα (105 U/L) and tumoraociated antigen (TAA) extracted from human bladder cancer cell line T24. The phenotypes (CD1a, CD80, CD86 and HLADR) were determined by flow cytometry. The proliferation of lymphocytes induced by DCs and the cytotoxicity of cytotoxic T lymphocytes (CTL) were aayed in the presence of NO. Bladder cancer cell line T24 was cultured as target cells and the cytotoxicity of CTL was determined by MTT aay. RESULTS: The proliferation of lymphocytes induced by DCs was inhibited by NO in a dosedependent maer (P<0.01). The NO resulted in an inhibition of the cytotoxicity of CTL agait bladder cancer cell line T24 (P<0.01). The DC in vitro induced by TAA effectively resulted in the proliferation of lymphocytes ［proliferation rate: (74±6)%］ and the killing effect was significant on the bladder cancer cell line T24 by CTL ［killing rate: (54±3)%］. CONCLUSION: NO can inhibit the proliferation and the activation of lymphocytes induced by DCs and downregulate the antitumor cytotoxicity of CTL in patients with bladder cancer.

　　【Keywords】 nitric oxide; dendritic cell; cytokine; bladder neoplasms

　　【摘要】 目的: 观察外源性一氧化氮（nitric oxide, NO）对膀胱癌患者外周血树突状细胞(dendritic cell, DC)的影响. 方法: 膀胱癌患者外周血中分离出单个核细胞，用粒/巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）、白细胞介素4（IL4）、肿瘤坏死因子（TNF）α和肿瘤相关抗原（tumor aociated antigen, TAA）培养DC细胞. 外源性NO干预后DC刺激自体淋巴细胞的增殖和细胞毒性T细胞(CTL)对膀胱癌T24的杀伤效应，用MTT法检测. 结果: 外源性NO可明显抑制DC刺激的自体淋巴细胞增殖，在NO浓度分别为50， 100， 200和400 nmol/L时淋巴细胞增殖率分别为(67±3)%，(40±6)%，(24±2)%和(18±3)%（与对照相比P<0.01）；显著下调DC诱导CTL杀伤T24的细胞毒作用，用相同的NO浓度梯度干预，杀伤率分别为(45±4)%，(38±3)%，(32±3)%和(22±1)%（与对照相比P<0.01）. 未受干预的DC能显著引起淋巴细胞的增殖，增殖率为(74±6)%；无NO干预DC诱导的CTL能特异性杀伤膀胱癌T24，杀伤率为(54±3)%. 结论: 外源性一氧化氮能引起膀胱癌患者DC递呈抗原能力的下降，下调由DC刺激的淋巴细胞增殖及DC诱导的CTL杀瘤效应.

　　【关键词】 一氧化氮；树突状细胞；细胞因子；膀胱肿瘤

　　0引言

　　观察外源性一氧化氮(NO)对膀胱癌患者树突状细胞(dendritic cell, DC)刺激自体淋巴细胞增殖的影响以及NO对DC诱导CTL杀伤膀胱癌T24的影响，观察外源性NO对DC递呈抗原功能的关系.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　病理证实膀胱癌患者外周血来源于兰州医学院第二医院泌尿外科，膀胱移行细胞癌株T24购自中科院上海生化细胞所细胞库，rhGMCSF，rhIL4和rhTNFα购自英国Peproteche公司, RPMI 1640培养基购自Gibco公司，MTT购自Amresco公司. 抗CD1a, CD80和CD86购自美国Ebioscience，HLADR购自美国Caltag公司. 流式细胞仪（美国，Flow Cytometer Coulter Epics XL）.

　　1.2方法

　　膀胱癌患者10(男8，女2)例，年龄28～60岁，病理Ⅰ级5例,Ⅱ级4例,Ⅲ级1例. 第一次手术前未用任何药物, 采集外周静脉血10 mL，淋巴细胞分离液分离出单个核细胞. 用含100 mL/L F的RPMI 1640液悬浮细胞，37℃，50 mL/L CO2孵育箱内孵育2 h，获得贴壁细胞. 用含有rhGMCSF 1×106 U/L，rhIL4 5×105 U/L，100 mL/L F的RPMI 1640液培养贴壁细胞. 每3 d离心法换液1次，d 3加入肿瘤相关抗原（tumor aociated antigen,TAA)，d 7加入rhTNFα 1×105 U/L，换液时追加TAA和rhTNFα. DC培养9 d后经流式细胞仪鉴定细胞表型（CD1a, CD80, CD86, HLADR表达率分别为0.60, 0.60, 0.88, 0.98）. 收集对数生长期的T24细胞，悬浮于100 mL/L F的RPMI 1640培养液中，置-80℃冰箱30 min，37℃放置10 min，反复冻融3次，镜检无细胞，细胞培养无细胞生长，即得TAA，TAA用0.2 μm滤器过滤后置-80℃冰箱保存备用［1］. 取培养9 d的DC与淋巴细胞按1∶50的比例混合培养，置含有IL2 2×105 U/L, rhGMCSF 1×106 U/L，rhIL4 5×105 U/L的完全RPMI 1640液中，37℃，50 mL/L CO2孵育箱内继续培养3 d即得CTL. 硝普钠作为NO的供者，作用浓度分别为400，200，100和50 nmol/L. 将NO干预浓度分成400， 200， 100， 50和0 nmol/L共5组，分别作用于DC刺激的自体淋巴细胞反应体系以及DC诱导的CTL杀伤T24的反应体系，以NO干预浓度0 nmol/L为对照组，每组皆3个复孔［2］.

　　1.2.1NO作用于DC刺激的自体淋巴细胞反应体系以培养10 d成熟的DC为刺激细胞，加入含有50 mg/L丝裂霉素C, 100 mL/L F的RPMI 1640液，置37℃，50 mL/L CO2孵箱中培养45 min，Hanks液洗涤3次. 按DC密度4×104个/孔，淋巴细胞2×105个/孔加入96孔板，即DC∶淋巴细胞=1∶5的刺激比例组成反应体系，进行NO干预. 分成5组，未加入NO的DC/淋巴细胞组为对照组，每组各设3个复孔，终体积均为300 μL. MTT法测定淋巴细胞增殖效应. 淋巴细胞增殖率=（实验组A值-淋巴细胞自体增殖组A值）/淋巴细胞组A值×100%

　　1.2.2NO作用于CTL杀伤T24的反应体系对数生长期T24细胞作为靶细胞，按5×103个/孔加入96孔板，37℃，50 mL/L CO2培养24 h. DC诱导的CTL为效应细胞，以效/靶比40∶1作为反应体系，NO浓度分成5组，加入反应体系. 未加入NO的CTL/膀胱癌细胞T24组为对照，每组皆3个复孔. 终体积均为300 μL. 在37℃，50 mL/L CO2孵育箱内培养24 h后，弃去上清液，用20 mL/L F的RPMI 1640液轻洗一遍，加入MTT工作液（5 g/L）20 μL. 继续培养4 h，加入DMSO终止液100 μL，静置40 min，待蓝紫色沉淀物溶解后酶标仪测定570 nm处A值. 细胞杀伤率=（未处理组A值-实验组A值）/未处理组A值×100%

　　统计学处理：采用 8.0统计软件，NO作用后，DC刺激淋巴细胞的增殖率以及CTL对膀胱癌T24的杀伤率用x±s表示，采用单因素方差分析. P<0.05表示差别有统计学意义.

　　2结果

　　2.1NO对DC刺激淋巴细胞增殖的影响NO对DC刺激淋巴细胞增殖有显著的抑制作用,且有浓度依赖性. 外源性NO 0 nmol/L为对照组，50~400 nmol/L NO作用后的淋巴细胞增殖率与对照组相比，有显著统计学意义（F=191.29,P<0.01）. 随NO作用浓度的增高淋巴细胞增殖率逐渐减小,在NO浓度为400 nmol/L时DC刺激的淋巴细胞增殖率最低, 抑制作用最强（Tab 1）.表1外源性NO作用后DC刺激淋巴细胞的增殖率及诱导CTL对膀胱癌T24的杀伤率（略）

　　2.2NO对DC诱导的CTL杀伤T24的影响NO对DC诱导的CTL杀伤膀胱癌T24有显著的抑制作用. 外源性NO 0 nmol/L为对照组，NO 50~400 nmol/L作用后的CTL杀瘤率与对照组相比，有显著统计学意义（F=179.57, P<0.01）. 随NO作用浓度的增高杀瘤率逐渐减小，显示NO的抑制作用有明显的浓度依赖性. 无NO干预时杀瘤率为(54±3)%，NO 400 nmol/L时杀瘤率则下降到(22±1)%（Tab 1）.

　　3讨论

　　DC是目前所知功能最强的抗原呈递细胞，在肿瘤免疫中具有重要的地位. 通过改变DC的抗原呈递能力可改变抗肿瘤免疫,有利于临床治疗. DC是原发性混合淋巴细胞反应中的主要刺激细胞，可刺激Th细胞发生增殖反应. DC主要通过分泌IL12来实现对淋巴细胞的增殖［3］. 当DC功能缺陷或数量减少时这种增殖能力减弱. 本研究结果显示外源性NO在四种不同浓度皆可抑制由DC刺激的淋巴细胞增殖，随NO浓度的下降这种抑制能力减低. 提示外源性一氧化氮对膀胱癌患者DC有抑制作用.

　　DC可把MHCⅠ/肿瘤抗原肽呈递给CTL细胞，并表达协同刺激分子以诱导CTL的应答，产生杀瘤效应. 本实验结果显示NO可明显抑制DC特异性CTL对膀胱癌T24的杀伤效应，在四种不同的浓度皆有抑制，且有浓度依赖性，随浓度的降低表现为抑制作用的逐渐减弱. 提示NO可能下调DC呈递肿瘤抗原给CTL细胞的能力，从而降低了CTL细胞对T24杀伤效应。

　　NO具有双重性，高浓度的NO在机体中表现为细胞毒作用，一氧化氮也是肿瘤细胞凋亡所必须的调节信号之一；低浓度的NO可通过促进血管生长和调节血流量促进肿瘤的生长. 实验证实NO在发挥细胞毒作用的浓度要比促血管生成、促瘤的浓度高10～100倍［4］. Stanford等［4］研究显示外源性的NO通过破坏线粒体膜电位，导致半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caase3)的激活，促进DC的凋亡. 这些研究与本实验结果一致. 我们认为外源性NO对膀胱癌患者的DC功能有抑制作用，下调了DC抗原呈递能力.

　　【参考文献】

　　［1］ 孙诚谊, 孙早喜, 王福生. 树突状细胞的扩增及培养上清液对胰腺癌细胞凋亡的研究［J］.中华实验外科杂志, 2003; 20（12）:1089-1091.

　　Sun CY, Sun ZX, Wang FS. Amplification of dendritic cell and effect of culture supernant on PC3 apoptosis ［J］. Chin J Exp Surg，2003；20（12）:1089-1091.

　　［2］ 王志平, 陈一戎, 郑荣梁,等. 活性氧自由基对膀胱癌患者淋巴因子激活的杀伤细胞的作用［J］. 中国药理学报, 2002; 23（3）:257-262.

　　Wang ZP, Chen YR, Zheng RL, et al. Effects of reactive oxygen ecies on lymphokineactivated killer cells in patients with bladder cancer ［J］. Acta Pharmacol Sin，2002；23（3）:257-262.

　　［3］ Nishioka Y, Wen H, Mitani K, et al. Differential effects of IL12 on the generation of alloreactive CTL mediated by murine and human dendritic cells: A critical role for nitric oxide［J］. J Leukoc Biol， 2003；73（5）: 621-629.

　　［4］ Stanford A, Chen Y, Zhang XR, et al. Nitric oxide mediates dendritic cell apoptosis by downregulating inhibitors of apoptosis protei and upregulating effector caase activity［J］. Surgery， 2001；130（2）: 326-332.

　　通讯作者：王志平. Tel.(0931)8942498

　　作者简介：郭涛（1969），男（汉族），甘肃省兰州市人. 硕士生(导师王志平). Tel.(0931)8942469Email.guotaourol@yahoo.com.cn

　　(兰州医学院第二医院泌尿外科研究所，甘肃 兰州 730030)

　　编辑许昌泰