非遗传毒性致癌物的检测

研究显示遗传毒性化学物质可显示多种属致癌性，经常是双性别，化学物质处于中间剂量组，不限于一种靶组织，即遗传毒性致癌物。多数化学物质的致癌性能通过确定的遗传毒性检测方法预测，不需要生物检定。然而，缺乏遗传毒性，却显示出致癌性，并且这种致癌活性存在于单一种属、单一性别甚至单一组织中，并仅存在于高剂量水平，这类化学物质即是非遗传毒性致癌物，这类物质的数量在逐年增加。非遗传毒性致癌物的致癌作用，不能由标准的遗传毒性分析所预测。与遗传毒性致癌物损伤DNA的作用相反，非遗传毒性致癌剂不能直接作用于DNA，不会使DNA的初级序列发生改变，但能改变或抑制某些与增殖和分化有关的基因和细胞事件，从而影响细胞增殖及信号传导功能，诱导肿瘤发生，其中部分涉及与细胞内特殊受体的结合反应。现在少数体外方法用于检测非遗传毒性致癌物，但没有一种方法通过国际验证，因此，化学物质在体外显示出非遗传毒性，还需进行体内啮齿动物检测，这取决于该物质的预期使用及人类暴露水平。近年，非遗传毒性致癌物对人类健康危害的影响被关注，一些机构如国际谐调委员会（ICH）讨论发展和验证小鼠转基因分析替代小鼠体内试验。多数方法仅可检测遗传毒性化学物质，但也有少部分方法可以特异地检测某些类型的非遗传毒性致癌物，然而没有单独的转基因体系或联合体系有足够高的敏感性和特异性用于啮齿动物致癌性研究。事实上，非遗传毒性致癌物研究中还存在很多问题，遗传毒性和非遗传毒性化学物质在某些分析中，其活性作用出现重复交错现象，该现象与化学物质作用方式不同有关；致癌物在某些模型上引发肿瘤形成的机制不完全清楚；在程序标准化和有效利用前，还需要更多努力。常用致癌性检测方法啮齿动物生物分析，使用大、小鼠长期体内分析检测致癌物质、肿瘤启动子和辅助致癌物。这种方法耗时、费力且非常昂贵。利用大鼠体内试验结合小鼠转基因分析检测致癌物，也存在从啮齿动物试验结果外推到人的困难。此外，大鼠和小鼠数据没有良好的相关性，相关信息外推到人均存在一定问题。
以细胞转化的形态学特征为基础对化学物质的致癌过程进行模拟。一些细胞转化试验以永生或非永生的啮齿动物细胞系为基础，可以较好地检测人和动物致癌物以及一些肿瘤启动子。事实上，许多致癌作用的假定阶段及致癌基因的作用，都是由体外细胞转化研究确定的，细胞转化的主要检测终点，灶性形成和软琼脂上生长能力，主要由于接触抑制和支持物依赖性丧失。一些能在体外培养物上检测和定量的细胞内检测终点，以及体内致癌作用和恶性肿瘤之间的关系，可由变异细胞接种后恶性肿瘤的形成得以证明。对致癌作用后期阶段的模拟逐渐地变得困难，因此，肿瘤细胞侵袭力和转移的体内试验受限于其详细过程不清楚，因此，必须进行体外研究。好的实例是体外三维侵袭力分析，以及Devaney等后期技术的精炼。另外，肿瘤新血管发生可在鸡胚脲囊膜上进行研究。近年2种细胞转化体系被发展，巴比系小鼠成纤维细胞（Balbc/3T3）和叙利亚仓鼠胚胎细胞（SHE）分析，可用于啮齿动物致癌物检测，其可靠性和预测能力都得到了改善，能用于不同实验室，有较高重复性。与其它啮齿动物体内试验替代法相比，包括小鼠转基因试验，SHE细胞分析对啮齿动物致癌物有较高的敏感性，可检测人类致癌物，但对啮齿动物致癌物和人体致癌物的辨别能力很弱。对数据库中48种化学物质进行分析，在较低PH条件下，体外细胞转化和啮齿动物体内致癌性分析结果的相关性是85%，敏感性和特异性分别为87%和83%。另外，在PH6.7条件下，对75种化学物质进行分析，其相关性为83%，敏感性和特异性分别为83%和82%。细胞转化分析技术要求较高，有待于解决，尽管在低PH值条件下，SHE能在不同实验室实施，但其相对于其它啮齿动物细胞转化分析要求更复杂，因此，所有的细胞转化试验在进行有效性评估前都需进一步发展。现在国际机构接受细胞转化数据提供的化学物质作用机制信息。认为细胞转化数据有助于化学物质选择并给出有用的机制信息。人类细胞在体外培养时也存在形态上的转化，人类细胞转化分析的发展，将消除种属外推的困难。利用数据库发展和分析结合计算机方法对遗传毒性和致癌性进行预测有大量优点，不同结构特征的遗传毒性化合物被识别，美国毒理学会致癌性的短期检测方法能用于化学物质致癌性预测，特别是遗传毒性致癌物。利用碎片分析，18种不同结构的化学物质毒性基团被确定，这些物质在啮齿动物长期体内试验中显示出致癌作用，以及利用一种或多种短期遗传毒性分析试验均显示其有遗传毒性。然而碎片分析法对一种取代基与其它基团的相互作用关注不够，需要增加更复杂的检测方法如QSAR方法和三维模型与知识库系统的结合等。
点突变、染色体损伤、非整倍体和其它与细胞增殖有关的毒性作用均可导致细胞转化的形态学改变。然而由于非遗传毒性致癌物作用机制广泛，特别是其具有高度组织特异性（如甲状腺致癌作用和过氧化酶体增殖），因而细胞转化分析和结合一种非整倍体因素分析对于所有类型非遗传毒性致癌物的检测是不可能的。因此，为增加体外可检测的非遗传毒性致癌物的范围，必须发展系列检测方法对物质作用的主要终点进行检测。一些细胞培养方法用于观察组织特异性细胞增殖的诱导，如MCF－7细胞分析，开始用于具有激素活性的物质和乳腺癌的检测。另外，一些非遗传毒性肝癌形成的受体被确定，并促进快速配体结合分析的发展。大量的化学物质可直接或间接激活中性粒细胞和巨噬细胞等炎性细胞，产生活性氧和其它自由基，作用于DNA而诱导肿瘤的发生。DNA甲基化与肿瘤形成密切相关，可引起基因表达变化，但不涉及DNA序列的改变。环境非遗传毒性致癌物的一个重要机制是通过改变基因组甲基化水平，导致基因表达模式异常，进而诱发肿瘤。DNA的甲基化状态可以成为非遗传毒性致癌物的暴露标志物，是继基因突变和遗传物质丢失以外，导致肿瘤抑制基因失活的第三条途径，而且在某些情况下是抑癌基因失活的唯一机制。因此研究DNA甲基化有助于全面了解环境致癌物的致癌效应，揭示化学毒物的致癌机制。增殖细胞核抗原(PCNA )是一种细胞周期蛋白, 它能与DNA 聚合酶结合形成四聚体, 参与DNA复制中引导链的形成, 从而促进细胞增殖,是细胞DNA合成不可缺少的因素。PCNA蛋白表达异常, 可诱导细胞异常增殖，增加细胞增长速率，使DNA复制错误及诱发或自发的突变频率增加，可能是非遗传毒性致癌作用的机制之一。细胞间隙连接通讯(GJIC)是嵌在细胞膜上的大分子蛋白，受到至少15种基因的调控, 并表现出肿瘤抑制基因的特点。Ca2+、cAMP、三磷酸肌醇、葡萄糖、维生素及其他参与生长调节的物质可以通过间隙连接为相邻细胞所共有。因此GJIC可以协调不同组织、细胞间的代谢和电传导性, 使各种信息有效地达到相应的细胞，保持细胞群体对生长刺激和调节反应的同步性，使细胞的增殖、分化按正常的程序进行。GJIC被抑制, 细胞的增殖和凋亡的调控信号传递失控, 导致细胞过度增殖, 而衰老和异常的细胞不能正常死亡, 在受到有害因素作用时极易发生恶变, 最终可形成肿瘤，目前GJIC已成为非遗传毒性致癌物筛检实验的观察终点。