胰腺癌的早期诊断中基因诊断方法有哪些?

 

 

(1)癌基因和抑癌基因：有关胰腺癌的癌基因和抑癌基因的研究进展非常迅速。这些基因绝大多数与细胞生长、分化、凋亡的调控紧密亲密相关。研究发现，胰腺癌的发生与多个基因的改变有关，是多次基因打击的结果，包括癌基因K-ras、抑癌基因p53、p16、DPC4等的改变。其中，癌基因K-ras第12号密码子的点突变见于90％左右的胰腺癌，远远高于它在其他肿瘤的突变频率。已有相称多的人利用这一特点进行胰腺癌诊断的临床研究，并显示了一定的临床价值。但目前报道均限于回顾性分析，缺乏前瞻性研究。跟着检测K-ras突变技术敏感性的进步，在胰腺癌的一些增生灶或癌前病变、胰腺原位癌中检测到了K-ras基因的突变，表明K-ras基因突变可能是胰腺癌发生的早期事件。有报道从细针抽吸(FNA)物，甚至胰液、十二指肠液中检测到K-ras基因的突变，这为胰腺癌的早期诊断提供了可能，但这些方法还存在取材较难题的题目。研究发现，在正凡人的血浆中存在极微量的DNA，其浓度大约10ng/ml，而肿瘤病人血浆DNA浓度经常超过100ng／ml。这种DNA来源于恶性肿瘤细胞，其中胰腺癌病人血浆DNA含量高达650ng／ml。有可能应用PCR方法检测到其中突变的K-ras基因。最近，英国的Mulcahy等从胰腺癌患者提取DNA，应用两步PCR-RFLP(限制性片断长度多态性)法分析K-r舾基因突变，阳性率达81％，其突变方式与肿瘤组织中K-ras突变方式一致，其中4例在临床诊断为胰腺癌之前就检测到K-ras突变，表明这是一种较敏感的方法，而且标本易于获得。这一研究成果推进了K-ras基因突变检测的临床应用，将有助于进步胰腺癌的术前定性诊断水平。因为血浆DNA含量很少，高敏感的DNA提取方法和K-ras突变检测方法成为研究的方向之一。但是，因为在慢性胰腺炎患者的粘液细胞增生灶中K-rag基因的突变也较常见，因而单独分析K-ras基因突变诊断胰腺癌的特异性还不够令人满足。p53是最常见的肿瘤按捺基因，p53基因的突变也常见于50％～70％胰腺癌p16基因编码的蛋白p16是一种CDK4的按捺物，在80％以上的胰腺癌中失活，失活方式多数是一条等位基因的突变伴另一条等位基因失活的频率在细胞株中远远高于原发癌中。最近报道的DPC4基因编码的蛋白在细胞生长TGF-13信号传导途径中起重要作用，该基因的失活见于60％的胰腺癌，其中40％为纯和性缺失，20％为突变等等。这些基因群的缺陷是胰腺癌有别于其他恶性肿瘤的特点之一，在分子诊断方面可能有一定作用。但这些抑癌基因的检测方法较为复杂，目前还未见有将之用于临床诊断方面的研究报道。

 

 

 

(2)端粒酶活性：端粒是位于真核生物染色体末真个特殊结构。人的端粒由很多简正直复序列(TYAGC~)和结合蛋白质组成。端粒具有防止染色体末端丢失和融合、不乱染色体、调节正常细胞生长等重要生物学功能，被誉为正常细胞的“分裂钟”(mitosisclock)。在正常细胞增殖的过程中，端粒逐渐缩短，当端粒缩短到一定程度时，细胞分裂休止。端粒酶是由RNA和蛋白质组成的核糖核酸一蛋白复合物，其本质是一种反转录酶。它以自身RNA为模板在其蛋白组分的催化下，合成端粒重复序列，加至染色体末端。研究表明，除造血干细胞、淋巴细胞、皮肤基底细胞等少数具有自我更新能力的增殖细胞外，人正常体细胞端粒酶活性均为阴性，而90％左右的恶性肿瘤细胞端粒酶呈活化状态。端粒酶活化是细胞获得不死性的枢纽，也就是说端粒酶激活是细胞癌变的一个特点，因而以为端粒酶可能是一个肿瘤标记。胰腺癌是一高度恶性的肿瘤，其肿瘤细胞生长迅速，端粒酶可能呈持续活化状态。最近Hiyama等应用以PCR方法为基础的端粒重复序列扩增法(TRAP)检测了43例胰腺癌和11例良性胰腺肿瘤组织标本中端粒酶活性，结果有4l例(95％)胰腺癌组织中端粒酶活性呈阳性，而所有11例良性胰腺肿瘤均呈阴性。在36例癌旁“正常”组织中，5例呈低阳性，其中2例术后病理证明有癌细胞的微浸润。结果提示端粒酶在正常胰腺和良性胰腺疾病时处于按捺状态，而在胰腺癌时重新持续激活，表明端粒酶活化在胰腺癌的发生中起重要作用，并可以作为一个有价值的诊断指标。为了评价检测端粒酶活性对诊断胰腺癌的临床价值，又应用内镜方法术前收集了32例怀疑为胰腺肿瘤患者的胰管细胞刷取液，用TRAP法检测其中端粒酶活性，与术后病理诊断进行比较分析。结果显示所有17例良性胰腺疾病(其中包括12例慢性胰腺炎)中均未检测到端粒酶活性，而在15例胰腺癌中13例(87％)为阳性，同期胰液细胞学诊断阳性率只有56％(8／15)。有意义的是，其中一位胰液细胞学诊断为良性的原位癌患者，胰液端粒酶活性为阳性。因此，假如能进一步扩大病例证明上述发现，应用内镜收集胰液，检测脱落胰腺导管细胞的端粒酶活性将是一个诊断胰腺癌的较好而且较早的方法。

 

 

 

(3)CCK-A受体基因：近年来，胃肠道激素在胰腺癌发生中的作用日益受到正视。胆囊收缩素(CCK)又称促胰酶素，是人正常胰腺生长过程中的一个重要调节介质，在胰腺癌的发生中也起重要作用。CCK受体基因分为两型：CCK-A受体和CCK-B受体(又名胃泌素受体)。CCK受体基因的克隆为研究CCK受体基因在各组织中的表达和功能奠定了基础。人体CCK-B受体广泛分布于中枢神系统和胃肠道等组织，在多种肿瘤中也都有表达。研究发现，CCK-A受体在胰腺组织中的表达存在显著的种属特异的异质性，其在动物中的表达与人组织中的表达不一样。应用Northern印迹分析表明，很多动物如大鼠、豚鼠正常胰腺组织中有CCK-A受体基因表达，而在成人胰腺组织中却无CCK-A受体基因表达，只有CCK-B受体基因表达。人体胰腺组织中缺乏CCK-A受体表达与CCK刺激胰酶的分泌是通过神经源性机制(包括迷走传人途径)的研究结果相符。CCK在正常胰腺发育和胰腺癌发生中的作用以及CCK-A受体在组织中表达的异质性，促使人们探索癌变了的胰腺组织中CCK-A受体表达的情况。1997年Weinberg等应用RT-PCR法检测了人体多种器官来源的良恶性组织中CCK-A受体的mRNA表达，发现CCK-A受体基因转录本在所有检测的22例胰腺癌标本中表达，而15例正常胰腺组织和46例胰外肿瘤中，虽经2次PCR扩增仍未检测到CCK-A受体基因转录本表达；并且用原位杂交技术发现CCK-A受体表达定位于胰腺导管细胞，而不是在腺泡细胞。因为绝大多数胰腺癌是发源于导管细胞，因而CCK-A受体表达在胰腺癌发生中的作用备受关注，并极有可能成为一个新的特异标记。但目前海内外尚未见到有关CCK-A受体基因在慢性胰腺炎等良性胰腺疾病中

表达情况的报道，其诊断胰腺癌的价值尚待深入研究。

 

 

 

在胰腺癌的诊断上，目前还没有有效的筛查方法，也缺乏单一可靠的诊断试验。为了进步胰腺癌的早期诊断水平，必需利用多种途径获取检测标本，结合多个指标进行分析。应用分子生物学和免疫学方法，通过特异的基因标记和肿瘤标志物的检测，结合可能获得的细胞学资料(如胰液或FNA)，将进步胰腺癌的术前定性诊断水平，并有可能在早期诊断方面取得突破，终极进步胰腺癌病人的生存率。