人参皂甙Rh2对脑胶质细胞瘤侵袭性的影响

　　人参皂甙Rh2 对脑胶质细胞瘤侵袭性的影响

　　姚兴军1 ,洪新雨1 ,刘兴吉1 ,崔佳乐2

　　(1. 吉林大学第一医院神经外科,吉林长春130021 ;2. 吉林大学基础医学院药理教研室)

　　出处

　　中国实验诊断学　2005年2月　第9卷　第1期

　　(收稿日期:2004 - 09 - 12)

　　摘要:目的　探讨人参皂甙Rh2 对C6 胶质细胞瘤体内侵袭的影响。方法　将携带增强型绿色荧光蛋白( EGFP)基因的pegfp2N3 质粒体外转染C6 胶质瘤细胞,将C6 阳性克隆以立体定向法植入SD 大鼠脑实质内,建立大鼠胶质瘤移植模型。一周后经MRI 检测接种成功的大鼠,随机分成两组,采用阴性对照及腹腔给药的方法,用病理检查、荧光显微镜及MRI 观察Rh2 对胶质瘤侵袭的影响。结果　稳定转染EGFP 基因的C6 瘤细胞于体内、外均可发出绿色荧光,在荧光显微镜下易于区分肿瘤与非肿瘤区。16μl/ ml Rh2 可明显抑制肿瘤体内侵袭。结论　Rh2 降低了C6 瘤细胞的体内侵袭性,抑制肿瘤生长。

　　关键词:神经胶质细胞瘤;人参皂甙Rh2

　　中图分类号:R73914 文献标识码:A

　　The effects of genoside Rh2 on invasion of brain glioma in vivo YAO Xing2jun , HONG Xin2yu , LIU Xing2ji . ( The first hospital of jilin University xinmin street No. 2 130021 , China)

　　Abstract :Objective 　To investigate the effects of genoside Rh2 on the invasion and metastasis of rat brain glioma. In vivo.

　　Methods 　C6 rat glioma cells were transfected with the plasmid vector named Pegf2N3 which contained an enhanced green injected into the brain parenchyma of SD rats in order to establish a xenotransplanted tumor model. After Rh2 were injected in the xenotrans2 planted tumor model with 16 umol/ l dosages , their effects on glioma invasion were observed by MRI , pathology , elecronmicroscopy.

　　Results 　EGFP transfected C6 glioma cells gave off green fluorescence microscopy. Rh2 can inhibit the growth of glioma invasion.

　　Conclusion 　Rh2 can inhibit the growth of glioma.

　　Key words :glioma ; genoside Rh2

　　( Chin J Lab Diagn ,2005 ,9 :36)

　　脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,其发病率约占全部脑肿瘤的40 %～60 %。目前手术切除肿瘤是主要的治疗方法,但远期疗效很差,肿瘤切除后极易复发,这可能与瘤细胞在体内的侵袭性生长密切相关。已有实验证实,胶质瘤的侵袭性生长是一复杂的过程,它涉及到瘤细胞与其细胞外基质成分的多步骤、多阶段的相互作用,但它们影响瘤细胞侵袭的机制尚待进一步阐明。人参皂甙Rh2 分子式为C36H62O8H2O ,分子量640。化学名为20 (S)2人参二醇232氧2β2D2 吡喃葡萄糖苷,以下简称为(Rh2) 。是从人参中提取的天然成分,毒性低,属于小分子物质且为脂溶性容易通过血脑屏障。有研究表明Rh2 可诱导Caspase 激活通路使人肝细胞SKHEP21 出现凋亡,并伴有细胞周期动力学的特征性改变[1 ,2 ] 。我们已经证实了Rh2 具有体外抑制C6 胶质瘤细胞的增殖[3 ] ,但体内尚无实验证明。本研究建立了稳定转染增强型绿色荧光蛋白(EGPF) 基因的C6 瘤细胞株,并以此建立了C6 大鼠脑内移植瘤模型,初步探讨了外源性Rh2 对大鼠脑内C6 胶质瘤侵袭性生长的影响。

　　1 　材料与方法

　　1.1 　材料　C6 胶质瘤细胞(上海细胞生物学研究所) ;胎牛血清;RPMI 1640 培养基、胰蛋白酶(Hyclone 公司) ; G418 ,脂质体Lipofectamine ( GIBCO 公司) ; Pegfp2N3 质粒(Clontech 公司) ;小鼠抗大鼠GFAP (胶质酸性蛋白) 多克隆抗体(SIGMA公司) ;SABC 免疫组织化学试剂盒(武汉博士德公司) ;Rh2由本院有机化学实验室提供;雄性SD 大鼠,体重250～300 g(本校实验动物中心提供) ;立体定向头架(生理教研室提供) 。

　　1.2 　方法

　　1.2.1 　转染　C6 瘤细胞常规培养于10 %胎牛血清RP2MI1640 培养基内。当25 ml 培养瓶中的细胞密度达50 %时,更换新鲜培养基过夜。以无血清培养基分别稀释15 μl 的Lipofectamine 和2μg 的Pegfp2N3DNA 质粒至100 ul 后,轻微混匀,室温下静置30 min。用无血清培养基洗涤细胞3 次,将018 ml 无血清培养基加入DNA2Lipofectamine 复合物中,轻微混匀后滴加于细胞表面,孵育5 h ,加2 ml 20 %小牛血清2RP2MI 1640 培养基。48 h 后更换培养基,以G418 进行阳性转染瘤细胞克隆的筛选,G418 浓度为600μg/ ml 。维持筛选30 d ,挑出单细胞阳性克隆,扩增培养,将成功转染的瘤细胞命名为C62E。

　　1.2.2 　体外检测阳性转染细胞　以0125 %胰蛋白酶消化对数生长期C6 2E 细胞成单细胞悬液,PBS 洗涤两遍。取109个min - 1的单细胞悬液1 ml ,加入4 ℃预冷的无水乙醇2 ml ,振荡混匀,行流式细胞仪检测。按照上述方法取细胞标本,经3%戊二醛固定,行电镜观察。单细胞悬液接种于直径90mm培养皿中,细胞完全贴壁伸展后,弃去培养基,PBS 洗涤两遍,4 %多聚甲醛固定30 min。以非EGFP 转染的C6 细胞为背景荧光标准,在488 nm 波长光线激发下行荧光显微镜检测。

　　1.2.3 　建立大鼠胶质瘤模型　接种方法和靶点坐标选取大鼠右侧尾状核区为靶点,其坐标:前囟中点前1.0mm ,矢状缝右旁开315 mm ,硬膜下510 mm。大鼠经10 %水合氯醛腹腔注射麻醉(014 ml/ 100 g) 后,固定于日本产75 型立体定向仪。手术暴露颅骨标志,接前囟中点前1.0 mm ,矢状缝右旁开315 mm ,硬膜下510 mm 的坐标点定位钻孔,孔径1.2 mm ,用1 mm的微量注射器针头锐性刺破硬膜在立体定向引导下接种针垂直缓慢延伸至硬膜下6 mm ,然后延伸1mm至硬膜下5 mm靶点处,将细胞悬液1 ×106/ 20μl 以1μl/min 缓慢注入靶区,除针前留针5 分钟,使细胞充分沉积,避免反流。颅骨钻孔处以骨蜡封闭,缝合头皮。每只大白鼠每天给予青霉素10 万u 腹腔注射预防感染。

　　1.2.4 　药物治疗　在实验第1 周,10 %戊二醛麻醉大鼠生效后,用飞利浦MRI 机,采用头部及膝关节线圈,场强110 ,层厚3 mm ,间隔013 mm行核磁检查,活体观察肿瘤生长情况。

　　根据公式:肿瘤大小= a2 ×b ×π/ 6 (a 为肿瘤短径,b 为肿瘤长径) 计算肿瘤大小。将接种成功,有肿瘤生长的大鼠分成两组分成A ,B 两组,每组10 只,A 组白鼠每天给予16μmol/ lRh2 1 ml 腹腔注射。B 组对照组腹腔注射Rh2 溶剂1 ml 。2周后将大鼠麻醉后,活体经左心室颈内动脉注入DEPC 冲洗后,注入20 ml 多聚甲醛固定肿瘤标本10 分钟。解剖出大鼠全脑标本。固定于多聚甲醛中。24 h 之后行病理组织学检查。①普通病理检测:含肿瘤组织的脑标本经石蜡包埋后取

　　7μm切片,HE 染色。②免疫组织化学检测:肿瘤石蜡切片经脱蜡后与胶质酸性纤维蛋白(GFAP) 单克隆抗体做免疫组织化学检查,用ABC 法显色。人脑星形细胞瘤组织作阳性对照,磷酸缓冲盐溶液替代一抗作为阴性对照。③切片光镜下观察后,移至荧光显微镜下检测,激发波长仍为488 nm。

　　2 　结果

　　2.1 　细胞体外荧光显微镜、流式细胞计、电镜检测　在488nm波长光线激发下,经筛选获得稳定转染EGFP 基因的C6细胞阳性克隆可发出绿色荧光,其最大吸收峰为530 nm。FCM分析显示, 转染EGFP 的C6 细胞荧光表达阳性率为95 % ,结合细胞周期检测,可知荧光表达阴性的细胞多处于G0/ G1 期。3 组瘤细胞的电镜检测未见差异性改变。

　　212 　影像学检查　大鼠接种1 周后MRI 检查可见右尾状核区有肿瘤形成,40 只大鼠中共有32 只大鼠成瘤,以上结果经MRI 检查及常规病理HE 染色检查及GFAP 蛋白免疫组化检测证实。

　　将20 只大鼠分成A、B 两组按实验方法给予对照治疗,对照组大鼠在接种2 周时大多出现明显的颅内高压症状,表现为精神萎靡,食欲不振,偏瘫。对照组大鼠在2 周后症状明显加重,出现了昏迷,直至死亡。治疗组大鼠在整个实验过程中,均未出现精神萎靡,食欲不振症状,始终表现比较活泼。肿瘤前后变化比率见表1。

　　表1 　鼠脑胶质瘤治疗前后体积的变化

　　1 　　周 3 　　周

　　No矢状面 冠状面 轴位 体积 No矢状面 冠状面 轴位 体积

　　(mm) (mm) (mm) (mm) (mm) (mm) (mm) (mm)

　　A1 110 019 018 0172 210 212 118 7192

　　A2 110 018 017 0156 116 117 210 5144

　　A3 017 111 112 01924 116 116 119 4186

　　A4 018 113 111 11144 118 217 219 14105

　　A5 112 110 019 1108 210 211 117 7114

　　A6 113 114 116 21912 113 119 214 51928

　　A7 019 113 019 11053 215 311 117 13117

　　B8 111 019 017 01693 113 018 017 01624

　　B9 111 018 017 01616 013 018 016 01504

　　B10 112 110 111 1132 113 114 112 21184

　　B11 112 110 111 1132 016 017 018 01336

　　B12 019 018 017 01504 110 111 112 1132

　　B13 019 110 110 019 018 110 111 0188

　　t < 0105

　　在肿瘤大小方面,接种一周后检查头部MRI 见肿瘤的体积平均在019 mm3 ,3 周后复查头部MRI 肿瘤大小在对照组和治疗组之间出现了显著差别。对照组肿瘤大小都平均有所增加,而治疗组的肿瘤大小增加缓慢,部分肿瘤组织变小,周遍出现低密度水肿带。实体检查可以见到未经处理的大鼠脑内肿瘤呈淡黄色,呈现侵袭性生长,与周围脑组织边界欠清晰。病理学检测中HE 染色可见肿瘤在脑组织内弥漫性生长,细胞呈椭圆形和星形,细胞丰富,排列紧密,核染色深。瘤内及瘤周可见水肿。胶质纤维酸性蛋白(Glial Fib2rillary acidic protein , GFAP) 染色: 该基因位于17 号染色体(17q21) ,是主要存在于星形细胞中的一种中间丝机构蛋白。

　　研究表明GFAP 的表达与星形细胞的发育和分化有密切的关系。随着星形细胞的成熟,GFAP 的表达逐渐增强,因此,国内外的学者已将GFAP 作为星形细胞的特异性分化标记物[4 ] 。本实验中见全部肿瘤标本均为GFAP 阳性染色,呈现细胞质丝状黄染。然而HE 和组化染色均可大体区分肿瘤界限,但不能特异性地标记出肿瘤边界,尤其难以发现远离瘤体侵袭生长的少量瘤细胞。荧光显微镜检查可见瘤细胞发出强绿色荧光,瘤区与正常脑组织界限较易区分,且能发现侵袭生长的单个瘤细胞。本结果提示,以EGFP 标记的C6瘤细胞在体侵袭模型具有较强的可靠性,优于HE 和免疫组织化学方法。

　　3 　讨论

　　目前的实验动物模型及瘤细胞标记检测法,如HE 和免疫组化染色等,均难以使少量远处侵袭的瘤细胞可视化。EGFP 是一种化学性能稳定的小分子蛋白质,它能在488 nm波长光线激发下发出绿色荧光。该基因与靶基因相连接,不影响目的基因表达,并能较好地标识其位置,是一种新型的告基因。研究表明,各种载体介导的GFP 基因突变体在体外均能转染入多种瘤细胞并获得稳定表达, 我们将携有EGFP 基因的载体转染了C6 瘤细胞,体外检测证实,转染该基因并不影响C6 瘤细胞的超微结构、增殖速度和细胞周期;与对照组比较,其移植瘤成瘤率未受到影响;C6 细胞在体内可稳定表达EGFP ,EGPF 并能示踪瘤细胞的体内侵袭。故该

　　法要明显优于HE 和免疫组化染色,是一种研究瘤细胞体内侵袭的可靠方法。脑胶质瘤的侵袭性生长是瘤细胞与细胞外基质相互作用的多步骤、多阶段的复杂过程,包括细胞表面粘附分子等多种因子的参与。Rh2 从人参中提取的天然成分,毒性低,属于小分子物质且为脂溶性容易通过血脑屏障。我们已经证实了Rh2 具有体外抑制C6 胶质瘤细胞的增殖,其抑制机制可能和Rh2 具有诱导肿瘤细胞凋亡,抑制PCNA 基因的表达与转录有关,本实验证实了Rh2 具有体内抑制胶质瘤的生长,延长荷瘤鼠的生存时间,同时对大鼠无明显毒副作用,该研究对揭示胶质瘤体内侵袭的信号转导通路,研究与开发抗肿瘤侵袭的药物具有重要的理论和实际意义。

　　作者简介:姚兴军(1969 - ) ,男,医学硕士,主治医师。主要

　　从事脑肿瘤和脑血管病研究。

　　参考文献:

　　[1 ]Lee2KY, Park2JA , Chung E , et al . Ginsenoside2Rh2 blocks the cell cy2

　　cle of SK2HEP21 cells at the G1/ S boundary by selectively inducing the

　　protein expression of p27kipl [J ] . Cancer2lett , 1996 ,110 (1 - 2) :193.

　　[2 ] Park2JA , Kim2KW, Kim2SI. Caspase specifically cleaves p21 WAF1/

　　CIP1 in the earlier stage of apotosis in SK2HEP21 human hepatoma cells

　　[J ] . Eur2J2Biochem , 1998 ,257 (1) :242.

　　[3 ]李殿友,罗毅男,洪新雨,等. 人参皂甙Rh2 诱导C6 胶质瘤细胞凋

　　亡的实验研究[J ] . 中国肿瘤临床,2003 ,30 (7) :474.

　　[4 ] Sadatomo T. Yoshida J , Wakabayashi T, et al . New approach for the

　　treatment of med alloblastoma by transfection with glial fibrillary acidic

　　protein gene[J ] . Surg Oncol , 1996 ,5 (2) :69.

　　[5 ]洪新雨,罗毅男,崔佳乐,等. 立体定向大鼠脑内SHG244 人脑胶质

　　瘤模型的建立[J ] .