人参皂甙单体Rh2对K562细胞增殖和凋亡作用的实验研究

　　摘 要: 目的 研究人参皂甙单体Rh2( GS-Rh2)对人K562细胞增殖和凋亡作用的影响。方法 采用MTT比色法观察GS-Rh2对体外培养的K562细胞生长的抑制作用; 在光学显微镜下观察不同浓度GS-Rh2 对K562细胞的凋亡作用及计数凋亡率( AR)。结果 MTT比色法测定显示, 细胞经GS-Rh2作用后生长受抑制, 呈剂量依赖性和时间依赖性, 半数抑制浓度( IC50)为25. 8μg/ml 。结论 GS-Rh2能抑制体外培养的K562细胞增殖并诱导其凋亡。

　　关 键 词: 人参皂甙-Rh2; K562细胞; 增殖; 凋亡

　　近年来研究发现, 人参具有抗肿瘤、抗衰老等多种生物活性作用, 其主要活性成分人参皂甙( Ginsenoside, GS)能诱导肿瘤细胞的分化和凋亡, 从而发挥抗肿瘤的作用。人参皂甙单体-Rh2( GS-Rh2)是一种原人参三醇型皂甙, 是红参的主要抗癌成分。我们以人红白血病K562细胞株为受试对象, 研究GS-Rh2对K562细胞增殖和凋亡的影响, 从而为开发抗肿瘤新药提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　K562细胞株(购自中国科学院上海生物细胞研究所); GS-Rh2(购自吉林省宏久生物科技股份有限公司); RPMI1640培养基(购于美国Gibco公司); 小牛血清( FBS) (杭州四季青生物工程公司产品); 超净工作台(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司); CO2培养箱(上海易亮医疗器械有限公司); 倒置显微镜;酶联免疫检测仪。

　　1. 2 细胞培养

　　K562细胞用含12%小牛血清的培养液(含100IU/ml青霉素和0. 1mg/ml链霉素), 于37℃, 5%CO2恒温培养箱中培养, 细胞呈悬浮生长, 达80%左右时传代。

　　1. 3 药物处理

　　细胞传代后, 接种于96孔培养板内, 当细胞为50%~60%时, 换用含有不同浓度GS-Rh2的培养液。培养至预定时间后进行观测。

　　1. 4 GS-Rh2对细胞生长的抑制作用

　　取对数生长期细胞制成细胞悬液, 浓度为1*105ml-1, 接种于96孔培养板内, 每孔100μl，6h后加入不同浓度的GS-Rh2, 使终浓度分别为6. 25、12. 5、25、50和100μg/m,l 每一浓度组均设4孔。对照孔及调零孔加100l培养液。各孔总体积均为200μl 。分别在加药后6、12、24、48和72h采用MTT法检测各孔中细胞的抑制率。用酶联免疫检测仪在570nm波长下测各孔的吸光度( A值), 按下列公式计算抑制率( IR): IR(%) = ( 1-给药孔平均A值/对照孔平均A值) *100%。具体步骤见参考文献。根据不同浓度下的抑制率绘制量效曲线,由此计算出IC50值。

　　1. 5 胞光镜形态学观察

　　在倒置显微镜下观察各实验组和对照组细胞并拍照。

　　1.6 GS-Rh2诱导凋亡的时效关系

　　取25. 0μg/ml( IC50的近似值) GS-Rh2分别作用0、12、24和48h后, 检测凋亡率(AR)。

　　1.7 统计学分析

　　采用SPSS11. 0软件包计量资料t检验, 所有数据用x正负s表示。

　　2 结果

　　2. 1 GS-Rh2 对K562细胞生长的抑制作用

　　于药物处理后48h, 采用MTT法测得各组的抑制率( IR), 结果表明: K562细胞的抑制率对GS-Rh2的浓度有明显依赖关系, 当GS-Rh2 浓度为6. 25、12. 5、25. 0、50. 0和100. 0 g/ml时, IR分别为21. 5%、38. 6%、64. 2%、80. 4%和84. 6%, 采用SPSS统计软件进行曲线拟合, 计算出GSRh2 对K562细胞的半数抑制浓度( IC50) 为25. 8g/ml( 图1)。25μg/mlGS-Rh2 处理作用于细胞不同时间, 采用MTT法计算抑制率, 结果如表1所示。

　　2.2 细胞形态学观察

　　在倒置显微镜下可以观察到对照组K562细胞体积大, 多呈圆形, 核圆形或椭圆形, 核浆比例大, 胞浆内未见颗粒, 常聚集生长; 而实验组随着GS-Rh2浓度的增加凋亡的K562细胞逐渐增多且更加明显。部分细胞呈现典型的凋亡细胞形态学改变, 细胞分散, 体积缩小, 胞浆浓缩, 核浆比例减小, 细胞核膜消失, 细胞核断裂呈小块或碎片状, 但细胞膜较完整并可见凋亡小体, 见图2。

　　2. 3 GS- Rh2诱导K562细胞凋亡的时效关系

　　由表2可见, 在25μGS-Rh2 作用下, 凋亡率随作用时间延长而呈现递增的趋势。

　　3 讨论

　　1. GS-Rh2 是由人参中提取的天然活性成分, 可经不同途径而抑制多种肿瘤细胞株的生长, 但对K562细胞的生长是否有抑制作用尚未见报道。为此, 我们采用MTT法进行了初步探讨, 图1中显示GS-Rh

　　2能抑制K562细胞生长, 且这种抑制作用具有一定的剂量依赖性, 即随着GS-Rh2 浓度增加, K562细胞的存活率逐渐下降。其半数抑制浓度( IC50) 为25. 8μg/ml 。

　　3. 从图2和表2可见, K562细胞经过GS-Rh2作用以后, 在倒置显微镜下呈现出明显的凋亡形态, 细胞缩小, 彼此分散, 核碎裂呈小块, 胞浆浓缩, 形成明显的凋亡小体。表明GS-Rh2 能诱导K562细胞凋亡, 且凋亡率随作用时间延长而呈现递增的趋势。

　　4. 本研究表明, 在一定范围内, 凋亡细胞所占比例呈现出随GS-Rh2浓度增加及作用时间延长而递增的趋势。但50μg/ml组与100μg/ml组凋亡率差异无显著性(P> 0. 05), 说明GS-Rh2 达一定浓度后K562细胞的凋亡率不再随药物浓度的增加而进一步增加。这可能是由于细胞凋亡是一种在严格的程序性控制下发生的细胞死亡形式, 外界刺激通过信号传递系统到达细胞内是启动凋亡的必要条件, 随后在一定的内部程序控制下即通过细胞的中央调控使细胞出现凋亡的形态学改变, 当GS-Rh2 的浓度达一定值后, 凋亡率不再随药物浓度增加而增加。但具体诱导机制还有待于进一步研究。

　　许多抗肿瘤药物都可诱导或促进肿瘤细胞凋亡而发挥治疗作用。JiaWW等研究表明, GS-Rh2能增加多药耐药细胞株对化疗的敏感性, 从而有效的发挥抗肿瘤作用。本研究显示GS-Rh2 有抑制人K562细胞增殖并诱导其凋亡的作用, 从而为开发出一种抗白血病新药提供进一步的实验依据。