20_S_人参皂苷Rh2对人结肠癌细胞增殖和周期的影响

　　李秋影 炎璐璐 马晓慧 张莉华 张兰兰 郭治昕

　　(1. 天津中医药大学，天津300193;2. 天津天士力研究院药理毒理所，天津3004410)

　　摘要：

　　目的 研究20(S)-人参皂苷Rh2对人结肠癌Cacao--2和HT-29细胞增殖及周期的影响。

　　方法 采用荧光微孔法测定20(s)--人参皂苷Rh2对人结肠癌Cacao-2、HT-29细胞增殖的影响：利用显微镜观察给药后HT-29细胞形态变化：流式细胞术分析20(s)-人参皂苷Rh2对HT-29细胞周期分布的影响。

　　结果 20(S)-人参皂苷Rh2对Caco-2、HT-29细胞生长有抑制作用，并呈剂量依赖性：20(S)-人参皂苷Rh2作用48h后，对HT-29、Caco-2细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为19.68、26.79μg/ml;流式细胞分析结果现实，与对照组细胞相比，20(S)-人参皂苷Rh2能显著减少HT-29细胞的G0/G1期和G2/M期细胞比例，增加D期细胞比例。

　　结论 20(S)-人参皂苷Rh2可抑制人结肠癌细胞增殖，主要原因是阻滞细胞处于S期

　　关键词： 20(S)-人参皂苷Rh2：HT-29：Caco-2：细胞增殖：细胞周期

　　中图分类号：R996 文献标识码：A 文章编号：1001-1528(2001)11-1874-05

　　人身为五加科人参属植物人参Panax ginseng C.A.meyer的干燥根，是已有几千年应用历史的名贵中药。现代医学研究表明，人参中包含有机酸、维生素、糖类、无机盐、固醇、寡肽、多糖、挥发油类和人参皂苷等多种成分，具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射等多种生物活性。人参皂苷Rh2作为人参中一类主要生物活性成分，在癌症的治疗方面具有较强的活性，其中一人参皂苷-Rg3为主要成分的抗癌新药参一胶囊已作为中药一类新药上市。大量研究表明，人参皂苷Rh2也同样具有较好的抗癌活性，如通过抑制端粒酶活性从而诱导肝癌SMMC-7721细胞分化、通过介导细胞内Caspase一类半肽氨酸蛋白酶进行信号传导进而诱导人黑色素肿瘤细胞A375-S2细胞的增殖并诱导凋亡以及逆转耐药的白血病细胞等。药代动力学研究表明，人参皂苷-Rh2主要在肝、胃肠道分布;并通过线粒体途径包括P53、CASP5等多靶点诱导结肠癌SW480细胞凋亡，国内也有文献初步报道人参皂苷Rh2可抑制人结肠癌细胞株SW620和LOVO生长。从结构上，人参皂苷Rh2可分为S型和R型的构象，其中20(S)-人参皂苷Rh2单体(20(S)-G-Rh2)是植物中分离的主要构型。但20(S)-G-Rh2单体对人结肠癌细胞Ht-29和Caco-2的影响目前还未见报道。本研究旨在观察20(S)-G-Rh2对人结肠癌Caco-2和Ht-29细胞增殖及对周期的影响，以期为新药研发和临床治疗结肠癌提供理论依据。

　　1 材料和仪器

　　20(s)-G-Rh2(天津天士力药物研究院现代中药研究所，纯度为90%)：DMEM培养基(GIBCO-BRL公司);胎牛血清(G1BCO-BRL公司);二乙酸荧光素Flourescein Diacetate,FDA(Sigma);Cell Cy-cle Phase Determination Kit(Cayman Chemical Com-pany);流失细胞仪FACSCcalibur(Bechman Dickson公司);Caco-2、HT-29细胞由西河医科大学基础医学细胞中心引进，由本实验室传代培养;

　　2 方法

　　2.1 细胞培养于传代 将HT-29和Caco-2细胞至于37℃，饱和湿度5%CO2培养箱中常规培养，均用含10%热灭活胎牛血清，1%的抗生素(青霉素100mg/L和链霉素100mg/;)的DMEM完全培养基。细胞呈单层生长，达80%左右融合时，采用0.25%的胰酶和0.02%EDTA(1：1)混合消化液(胰酶)消化传代，取生长对数期的细胞用于实验。

　　2.2 荧光微孔法监测细胞增殖实验 将对数生长期的HT-29、Caco-2细胞，用胰酶消化，用DMEM完全培养基配成单个细胞悬液，调整细胞浓度为5×104个/mL。接种于96孔培养板中，每孔接种100μL，于37℃，饱和湿度5%CO2培养箱中培养24h后换液，空白对照组为DMEM培养基，实验组每孔加入50-12.5μg/mL5个浓度的20(2)-G-Rh2(用DMEM培养基配置)处理48h，每个浓度组及对照组君左3个平行孔。48h后吸弃板中培养基，加入100μL含2.5μg/mL二乙酸荧光素的PBS重复洗2变，甩去PBS并吸弃板中剩余的PBS，Leica DM16000B 电动倒置荧光相对显微镜在激发和发射波长分别为488nm和530nm下，测定每孔的荧光强度。根据荧光强度计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率，并求算出半数抑制浓度(IC50)，实验重复3次。细胞生长抑制率%=(1-给药组荧光强度/对照组荧光强度)×100%

　　2.3 显微镜观察细胞形态学变化

　　将对数生长期的HT-29、Caco-2细胞，用胰酶消化，用完全培养基配成单个细胞悬液，调整细胞浓度为5×104个/mL，每孔2mL细胞悬液细胞悬液种于放置盖玻片的6孔板中，培养细胞爬片生长。培养24h，带细胞在盖玻片上贴壁良好后，加入0.2mL20μg/mL20(S)-G-Rh2处理细胞48h，在倒置显微镜下观察细胞形态变化。

　　2.4 流式细胞仪检测细胞周期

　　将对数生长期的HT-29细胞，用胰酶混合消化液消化，用完全培养基配成单个细胞悬液，调整细胞浓度为5×104 个/mL。接种于6孔培养板中，每孔接种2mL，于37℃，饱和湿度为5%CO2培养箱中，每孔接种2mL，于37 ℃，饱和湿度5%CO2培养箱中培养24h后，换无血清的DMEM培养液同步化24h，加不同浓度的20(S)-G-Rh2处理细胞24h，加不同浓度的20(S)-G-Rh2处理细胞24h后，经胰酶(不加EDTA)消化，Assaybuffer洗2遍，(3000rpm，3min)，加入固定液固定2h，上机前离心弃去固定液，加入100mg/LR-Nase和5g/L碘化丙啶(PI)染色剂，染色避光30min，流式细胞仪检测细胞周期变化。

　　2.5 统计学处理

　　用SPSS10.0软件完成统计学处理，软件完成统计学处理，实验数据以均数±标准差即(X(-)±S)表示，组间分析比较采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

　　3. 结果

　　3.1 20(S)-G-Rh2对Caco-2和HT-29细胞增殖的影响 二乙酸荧光素(FDA)可透过细胞膜并脱脂释放荧光素积累在活细胞中，激发和发射波长分别为488nm和530nm，常用于检测细胞存活率。本研究采用FDA为荧光指标剂建立了微孔板法进行20(S)-G-Rh2对人结肠癌细胞Caco-2和HT-29的增殖影响研究。结果显示，20-(S)-G-Rh2对Caco-2和HT-29细胞增殖具有明显的抑制作用，其抑制作用随药物浓度而增强，呈现较好的剂量依赖性。计算药物对HT-29和Caco-2细胞的半数抑制率(IC50)分别为19.68μg/mL和25.79μg/mL。(结果如表1，图1、2)。

　　3.2 显微镜观察细胞形态学变化

　　20μg/mL 20(S)-G-Rh2处理48h后的HT-29细胞较空白对照组细胞成群贴壁生长、细胞透亮，折光性好。而给药组细胞之间互相脱离，颜色加深，贴壁细胞数量减少，细胞轮廓消失。(见图3)。

　　3.3 20(S)-G-Rh2对HT29细胞周期的影响

　　20(S)-G-Rh2处理24h后细胞，用流式细胞仪检测细胞周期各时相细胞数。结果显示;20μg/mL 20(S)-Gh2处理24h后HT-29细胞在细胞周期的分布发生娴熟性的变化。对照组G0/G1期、G2/M期、G2/M期、S期细胞比例分别为(76.78±4.0)%、(3.61±2.1)%和(19.60±3.59)%、(0.8±1.21)%及(54.54±2.17)%：给药组20(S)-G-Rh2的G0/G1期和G2/M期细胞比例明显的减少，S期细胞比例升高，与对照组有显著性差异(P<0.05)，具有统计学意义，(建表2，图4)。

　　4 讨论

　　结肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤，临床主要以手术治疗并术后放疗和化疗为主要治疗手段，但对晚期效果不佳。人参皂苷是人参的主要生物活性成分，人参皂苷单体中G-Rh2具有抑癌活性，并对正常组织毒性甚低。目前体内外实验结果表明：通过对细胞周期的影响，诱导细胞凋亡，从而时间和剂量依赖性的抑制多种多种肿瘤细胞的增殖。但20(S)-人参皂苷Rh2对人结直肠癌细胞Caco-2和HT-29的研究还未见到报道,因此本研究通过体外培养人结肠癌细胞Caco-2和HT-29细胞，考察20(S)-G-Rh2对人结肠癌细胞的凋亡及细胞周期的影响做初步的探究。本研究结果表明，20(S)-G-Rh2可抑制人结肠癌细胞Caco-2和HT-29细胞生长，且这一变化在实验范围内存在剂量依赖性，其IC50分别为19.68和26.79μg/mL。显微镜下现实：当一定剂量的20(S)-G-Rh2作用48h后的人结肠癌细胞HT-29出现明显的细胞死亡形态。肿瘤的发生是一个多步骤、多因素、多阶段改变的过程，其中细胞周期调控失控被认为是肿瘤发生的重要机制。细胞凋亡可发生在细胞周期的各个时相。采用流式细胞分析技术进行细胞周期研究，结果显示：20(S)-G-Rh2能显著减少HT-29细胞的G0/G1期和G2/M期细胞比例，增加S期细胞比例，说明20(S)-G-Rh2可阻滞人结肠癌细胞HT-29于S期。与β-拉帕醌阻滞结肠癌细胞SW480、SE620和DLD-1于S期进而导致凋亡的机制相同。综上所述，20(S)-G-Rh2可抑制人结肠癌Caco-2和HT-29细胞增殖，其抑制作用主要是由于其可阻滞细胞处于S期，S期为DNA辅助器，大量的DNA在此期间解旋复制，暴露活性位点，为化疗药物提供更多的靶点。20(S)-G-Rh2可阻滞结肠癌细胞于S期导致凋亡，可与阻滞细胞于G0/G1或G2/M期的化疗药物联合治疗结肠癌。但其确切的分子机制将有待于进一步探讨，20(S)-人参皂苷-Rh2单体将在临床防止肿瘤方面具有广泛的应用前景。