人参皂贰Rh2致MCF一7/ADM凋亡和逆转MCF一7/ADM多药耐药性的基础研究

　　摘要

　　第一部分:乳腺癌耐药细胞株体外模型的建立及其耐药机理研究

　　肿瘤细胞的多药耐药性 (Multidrugresistanee，MDR)是指肿瘤细胞接触一种抗癌药物产生耐药的同时，对其它结构和作用机理不同的抗癌药物亦产生交叉耐药。MDR的原因是复杂的，但MDRI基因过度表达产生的p一糖蛋白 (permeabilityglyeoprotein，p一gp)是MnR产生的最重要原因。本实验拟针对P一gP介导的多药耐药现象，建立人乳腺癌细胞系MCF一7的耐药细胞株，以便为探讨乳腺癌细胞MDR的发生机制，并探寻逆转MDR的有效方法和药物提供理想的体外实验模型。方法:通过阿霉素浓度梯度诱导法逐步培养出MCF一7的耐药细胞株MCF一7/ADM。MTT法测定并比较阿霉素(ADM)对MCF一7细胞和MCF一 7/ADM细胞的ICS。;通过罗丹明123滞留实验比较MCF一7细胞和MCF一7/ADM细胞内罗丹明123荧光强度的差别;RT-PCR和流式细胞仪比较MCF一7细胞和MCF一 7/ADM细胞内 mdrlmRNA表达及P一gp表达的不同。结果:历时6个月，成功培养出MCF一7的耐药细胞株MCF一 7/ADM。

　　MCF一 7/ADM细胞的 ADMICS。为 65.43士 3.94pM，显著高于MCF一7细胞的 ADMICS。一 1.12士 0.14pM(P<0.05)，两者相差约58倍;培养体系中加入等量罗丹明123，MCF一7lADM细胞罗丹明123荧光强度为(1.22士0.20)%，显著低于MCF一7细胞罗丹明123荧光强度(97.67土1.01)%(P<0，05)，两者相差约80倍;RT.PCR法显示出MCF一 7/ADM细胞内 mdrlmRNA高表达，MCF一7细胞内 mdrimRNA没有表达;流式细胞仪测定MCF一7lADM细胞内P一gp表达为99.80%，而MCF一7细胞内P一gP表达为53.70%，两者相比有显著差异。结论:MCF一7/ADM细胞具有典型的MDR现象，其产生MDR的机制主要为MDRI基因过度表达，导致P一gP过度表达，从而使细胞内药物浓度减少。此耐药细胞株的建立为进一步研究肿瘤细胞多药耐药的发生机制和研究逆转耐药方法提供了理想的实验工具。

　　关键词:MCF一7细胞系，多药耐药，MDRI基因，P一糖蛋白

　　第二部分:人参皂贰RhZ对MCF一7及MCF一7/ADM的抑制作用研究

　　目的:近年来，人们逐渐认识到促进肿瘤细胞的凋亡是恶性肿瘤治疗的新目标。大量研究表明，单味中药的有效成分及复方制剂在诱导肿瘤细胞凋亡中可以起重要作用。人参(PanaxginsengC.A)为五加科多年生草本植物，其成分具有诸多生物活性，人参皂试助2是由人参中提取的天然活性成分。大量研究证明RhZ具有非常显著的抗肿瘤作用，其抗肿瘤药理作用值得深入的研究。本研究拟以人乳腺癌细胞系MCF一7为受试对象，旨在研究Rh2在抑制MCF一7和MCF一7/ADM细胞增殖方面的作用及机理。方法:不同浓度Rh:分别作用于MCF一7及MCF一7/ADM细胞，应用MTT法确定各组细胞在24小时、48小时和72小时三个时间点的增殖抑制率;通过流式细胞仪检测RhZ对MCF一7及MCF一 7/ADM细胞坏死、凋亡和细胞周期的影响;并检测RhZ对MCF一7及MCF一7/ADM细胞easpase3活性的影响。结果:5~80pmol/LRhZ可以显著抑制MCF一7和MCF一7/ADM的增殖(P<0.05)，并有时间和剂量依赖关系;Rh:浓度 >80pInol/L后细胞抑制率则不再随灿:浓度增加而上升;RhZ对MCF一7细胞的抑制作用更强。40pmol/L助2主要通过导致MCF一7细胞坏死而抑制其增殖，坏死率为(31.9士2.55)%，凋亡率为(11.33士0.66)%，(P<0.05);而相同浓度灿2作用于MCF一 7/ADM细胞，则主要是通过Caspases途径诱导其凋亡，坏死率(7.28士0.20)%，而凋亡率达(26.49士2.42)%，(P<0.05)。RhZ对两种细胞周期的影响也有所不同:灿2使MCF一7细胞周期阻滞于S期，GZ/M期细胞减少;而在MCF一 7/ADM细胞中，变化却相反，RhZ导致S期细胞减少，GZ/M期细胞增多。结论:人参皂贰Rh:通过不同机制抑制了MCF一7和MCF一 7/ADM细胞的增殖:RhZ主要通过导致MCF一7细胞坏死而抑制其增殖;而对于MCF一7从DM细胞，则主要是通过Caspases途径诱导其凋亡。助:诱导耐药细胞系MCF一7/ADM凋亡的研究结果显示其在抗肿瘤作用方面的独特性。

　　关键词:人参皂贰RhZ，MCF一7细胞系，凋亡，坏死，细胞周期

　　第三部分:人参皂贰Rh:逆转MCF一7/ADM多药耐药性的研究

　　目的:恶性肿瘤对化疗药物的多药耐药是当今肿瘤化疗失败的主要原因，而MDRI基因过度表达产生的P一gp是多药耐药性产生的最重要原因，p一gp属于ABC(ATp一 bindingCassette)转运蛋白家族的一员，是一种能量依赖性药物转出泵，能将化疗药物从癌细胞内泵出细胞外，从而使药物在细胞内积蓄浓度降低，药物的细胞毒作用降低，导致肿瘤化疗的失败。因此，寻找低毒、有效的MDR逆转剂是肿瘤化疗领域急需解决的问题。中药治疗肿瘤不仅毒副作用小，而且作用途径比较广泛。近年大量研究表明，许多单味中药的有效成分及复方制剂在体外实验中有逆转肿瘤细胞MDR的作用。本实验的研究目的为:人参皂贰RhZ作为抗肿瘤作用非常显著的中药单体，是否具有逆转肿瘤细胞多药耐药性的作用，并探寻其机理。方法:RhZ与ADM作用于MCF一7及MCF一 7/ADM细胞，72小时后，MTT法比较单独应用ADM与ADM联合应用助2各组 ADMIC50的变化;罗丹明123加入MCF一7及MCF一7/ADM细胞，流式细胞仪分析不同浓度Rh:和维拉帕米抑制罗丹明123外排的情况;RT.PCR法和流式细胞仪检测Rh:对MCF一7/ADM细胞mdrlmRNA表达及P一gp表达的影响。结果:RhZ可以显著降低MCF一7/ADM的 ADMICS。(P<0.05)，40pmol/L灿:可使MCF一7/ADM的ADMICS。下降为2.14士0.26pM，耐药倍数仅为1.91，而对MCF一7细胞的 ADMIC50却没有影响;助2可以增加MCF一7/ADM细胞内罗丹明123荧光表达强度(P<0.05)，比维拉帕米抑制罗丹明123外排作用更强，在MCF一7细胞内灿2和维拉帕米均无此作用;RhZ对MCF一7/ADM细胞 mdrlmRNA表达及P一gp表达没有影响。结论:体外实验中，人参皂贰Rh:可以有效逆转P一gp介导的MCF一7/ADM的耐药性，是一种安全、高效的MDR逆转剂，可能成为具有广阔前景的抗肿瘤药物。

　　关键词:人参皂贰RhZ，MCF一7细胞系，多药耐药，逆转，MDRI基因，P一糖蛋白

　　前言

　　肿瘤细胞对结构、细胞靶点和作用机理迥然不同的抗癌药物同时产生耐药的现象称为肿瘤多药耐药 (multidrugresistanee，MDR)，是肿瘤化疗失败的主要原因。MDR可分为天然性耐药和获得性耐药。前者指细胞在未接触到上述MDR相关药物情况下即具有的多药耐药性，获得性耐药是指接触后才产生的耐药性。肿瘤多药耐药性是当前基础医学和临床医学研究的热门领域之一，也是肿瘤治疗中鱼待解决的难题。MDR产生的机制非常复杂，目前己提出多种可能的途径。其中，由人类多药耐药基因mdr一1所编码的P一糖蛋白 (Permeabilityglyeoprotein，P一gp)是主要耐药型之一。P一gp作为能量依赖的药物泵，将化疗药物主动泵出细胞外，降低肿瘤细胞内的药物浓度，从而导致肿瘤细胞的耐药性[zl。而要对产生MDR的肿瘤细胞化疗成功，需要破坏P一gp介导的药物抵抗，从而提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。预防和逆转多药耐药的研究早在10余年前即己经开展，其方法策略主要集中于发展P一gp的竞争性抑制剂及转录调节因子。如钙离子通道阻滞剂维拉帕米

　　(Verapamil)和环抱霉素A(cyelosporinA)等及其衍生物可逆转多药耐药性，但毒性过大和疗效不佳限制了这些药物的临床应用。近年来发展的转录后基因沉默 (Posttranseriptionalgenesileneing，PTGs)技术提示要阻止肿瘤细胞内P一gp介导的MDR，就要选择性地阻断P一gp特异性mdr一lmRNA的表达，从而抑制P一gp的合成，这种方法的目的是在提高耐药肿瘤细胞药物敏感性的效率和特异性的同时减少药物毒性和副作用，研究发现，应用反义寡核昔酸链和核酸酶可以成功地抑制mdr一1mRNA的过度表达Iv]。然而在实际应用中，由于抑制效率低，专一性较差和较大的毒性成为目前这一方法所面临的现实问题，另一方面，用药量较大、成本过高也影响其临床应用。近年来的研究发现，我国的名贵中药人参具有抗癌活性，其主要活性成分人参皂试(ginsenoside)能诱导细胞分化和凋亡而发挥抗肿瘤作用。其中 Rh:是从红参中提取的天然活性成分，属二醇组皂贰，分子式为C36H62OsHZO，分子量622，化学名为20(S)一人参二醇一3一氧一p一D-毗喃葡萄糖营(图l)，简称RhZ，属于小分子物质且为脂溶性〔3·”。国内外一些学者先后报道Rh:对多种肿瘤细胞如小鼠黑色素瘤B16细胞、C6胶质瘤细胞、人肝癌细胞SK一HEP一1等具有增殖抑制和诱导凋亡作用，并证明对正常细胞的毒性作用甚低【‘”一，3]。而充分利用中医扶正培本的理论，发挥中药在抗肿瘤研究中的作用，克服肿瘤细胞的耐药，提高化疗的疗效，是进一步提高肿瘤治愈率的努力方向和优势所在。本实验以人乳腺癌细胞系MCF一7为受试对象，研究Rh:对肿瘤细胞生长的抑制作用，并研究Rh:在逆转MDR方面的作用及其机理，旨在进一步阐述Rh2在抗肿瘤方面的机制。

　　第一部分：乳腺癌耐药细胞株体外模型的建立及其耐药机理研究

　　对象和方法

　　一、试剂与仪器

　　(一)细胞系与试剂

　　1.人乳腺癌细胞系MCF一7(天津医科大学肿瘤医院免疫室提供)

　　2.细胞培养液 RPMI1640(美国 Invitrogenlireteehnologies公司，含loou/ml青霉素和100只g/ml链霉素)

　　3.胎牛血清(美国Gibco公司)

　　4.Tris饱和酚、氯仿、异丙醇、无水乙醇、葡萄糖、NaCI(国产分析纯)

　　5.核酸提取试剂Trizol(美国 Invitrogenlifeteehnologies公司)

　　6.凝胶电泳试剂Agarose(美国sigma公司)

　　7.Superseript11逆转录试剂盒(美国Clonteeh公司)

　　8.AdvantagePolymerasemix(美国 Invitrogenlifeteehnologies公司)

　　9.EXTaq酶(日本TaKaRa公司)

　　10.dNTP(美国Promega公司)

　　11.ADM(美国Sigma公司)

　　12.MTT(美国Sigma公司)

　　13.罗丹明123(美国sigma公司)

　　14.0.25%胰蛋白酶(美国HyClone公司)

　　15.EDTA(美国Sigma公司)

　　16.DMSO(美国Sigma公司)

　　17.PE标记P一170鼠单克隆抗体(UICZ)(美国CHEMICON公司)

　　(二)仪器

　　1.常温离心机(德国Heraeus)

　　2.低温高速离心机(德国Heraeus)

　　3.水平及垂直电泳设备(BioRAD公司)

　　4.照相设备(BioRAD和Polaroid公司)

　　5.核酸定量分析仪 (BeckmanDU640)

　　6.pCR仪(Eppendorf公司)

　　7.荧光定量pCR仪GeneAmp5700(美国ABI公司)

　　8.倒置显微镜(olympus)

　　9.流式细胞仪 (Beckmaneoulter.EPICS.XL)

　　10.酶标仪 (BioTek.SynergyHT)

　　11.CO:培养箱(德国Heraeus)

　　12.制冰机(日本Sanyo公司)

　　13.GMP层流室(天津肿瘤医院免疫室提供，卫生部验收合格)

　　二、方法

　　(一)MCF一7细胞的培养

　　1.MCF一7细胞的复苏和培养

　　(1)取15ml离心管一支，加入10ml含10%FBS的 RPMI1640培养液。

　　(2)从液氮罐中取出冻存MCF一7细胞一支，将其放入37℃水浴，轻柔振荡lmin，使其解冻。待细胞完全溶化后，将冻存管放入70%乙醇中以清除表面污染。

　　(3)打开瓶口，用吸管将解冻的细胞吸入(1)步骤中准备好的15ml离心管中。

　　(4)将离心管在室温下离心，1000rmpxsmin，弃上清。再加入10ml含10%FBS的 RPMI1640培养液，重复离心一次，弃上清。

　　(5)在离心管中加入含10%FBS的 RPMI1640培养液以重悬细胞。

　　(6)将上步制备的细胞悬液分装入培养瓶中。置37oC、5%COZ孵箱中孵育。

　　(7)每日观察细胞密度，2一3天换一次培养液。

　　2.MCF一7细胞传代

　　(1)当细胞长至培养瓶的80%时，进行细胞传代。首先吸弃培养液，用

　　无菌PBS洗涤细胞两次。

　　(2)加入0.25%胰酶o.sml(加入胰酶量根据培养瓶大小有不同)，置于37“C、5%COZ孵箱中孵育l一3min。

　　(3)镜下观察细胞变圆时，加入含10%FBS的 RPMI1640培养液使胰酶失活。

　　(4)吹打细胞后，将细胞悬液吸出分装入新的培养瓶中，加入新鲜的培养液。置37oC、5%COZ孵箱中孵育。

　　3.MCF一7细胞冻存

　　(1)观察细胞生长状态，待细胞生长旺盛，进入对数生长期时，用上法胰酶消化细胞

　　(2)用含10%FBS的 RPMI1640培养液洗涤细胞一次，然后加入含10%DMSO的FBS，将沉淀细胞团吹打，分装入冻存管中，每管约lml。

　　(3)将冻存管放入一80℃过夜，然后放入液氮罐中保存，以备后用。

　　(二)MCF一7/ADM细胞的诱导、筛选和培养

　　1.将MCF一7细胞的培养液中加入o.lmg几阿霉素，筛选出存活细胞，用含0.lmg/L阿霉素的培养液培养细胞一个月。

　　2.逐渐增加阿霉素浓度，不断筛选出存活细胞继续培养。每次改变阿霉素浓度后均维持培养一月后再增加浓度。

　　3.选用在含有o.smg/L阿霉素的培养液中生长良好的细胞继续培养，即为MCF一7/ADM细胞。

　　4.MCF一7/ADM细胞的培养、传代、冻存及复苏同MCF一7细胞。培养液为含0.smg/L阿霉素和10%FBS的 RPMI1640培养液。

　　(三)阿霉素(ADM)对MCF一7和MCF一7/ADM细胞增殖的抑制实验

　　1.MCF一7和MCF一7/ADM细胞的准备

　　(1)取对数生长期细胞，当细胞长至培养皿的80%时，吸去培养液。使用sml无菌PBS洗两次。

　　(2)加入0.25%胰酶0.sml，置于37oC、5%COZ孵箱中孵育l~3min。

　　(3)镜下观察细胞变圆时，加入含10%FBS的 RPMI1640培养液使胰酶失活。

　　(4)吹打细胞后，将细胞悬液吸出转入15ml离心管中。

　　(5)将离心管在室温下离心， 800rmpxsmin，吸去上清。

　　(6)在离心管中加入含5%FBS的 RPMI1640培养液 1ml以重悬细胞，并计数。

　　(7)于离心管中继续加入含5%FBS的 RPMI1640培养液，将细胞浓度调整为2又loszml。

　　2.种板和加药

　　(1)将ADM溶于无菌PBS中

　　(2)选择拟设ADM浓度梯度制成 6580pmol/L(4mg/ml)母液备用。共11个。

　　(3)取%孔板，依ADM浓度梯度计算拟种孔数(每个浓度设3个复孔)，将细胞悬液吹匀后，用移液枪将MCF一7和MCF一7/ADM细胞分别种于孔中，每孔 50pl，细胞数为l只104。

　　(4)用含5%FBS的 RPMI1640培养液将ADM母液稀释为 172pmol/L(稀释40倍)，注入无菌Eppendorf管中，再依次倍比稀释，制成86pmol/L，43林mol/L， 21.5协mol/L， 10.75协mol/L， 5.33pmol/L， 2.67pmol/L，l.33pmol/L，0.67pmol/L和0.33pmol/L的ADM溶液。

　　(5)将各浓度ADM溶液按序加入各孔，每孔 50ul，使各孔终浓度依次为 86pmol/L， 43pmol/L，21.5林mol/L，10.75pmol/L，5.33pmol/L， 2.67pmol/L， 1.33pmol/L， 0.67pmol/L， 0.33mg/L，0.17mg/L以及opmol/L。Opmol/L为对照组，并设试剂对照孔。最终每孔液量为100pl。

　　3.MTT实验

　　(l)将96孔板置于37oC、5%COZ孵箱中，分别孵育20h，44h，68h。

　　(2)取出96孔板，室温下每孔加入MTT液 (smg/L)10pl。

　　(3)再次置于37oC、5%COZ孵箱中，孵育4h

　　(4)将96孔板在室温下离心，1000rmpxsmin，弃上清。

　　(5)每孔加入DMSO100pl，置室温中避光放置30min。

　　(6)上酶标仪震荡305，在波长57Onm段测定各孔吸光度值(A值)。进而计算出细胞生长抑制率，并估算出ADM对MCF一7和MCF一 7/ADM细胞的半数抑制率 (ADMIC50)。细胞生长抑制率二【1一(实验组A值一试剂对照组A值)/(对照组A值一试剂对照组A值)IX100%

　　4.实验重复3次。

　　(四)细胞内罗丹明123留滞实验

　　1.MCF一7和MCF一7/ADM细胞的准备

　　(1)取对数生长期细胞，当细胞长至75cm2培养皿的80%时，吸去培养液。使用10ml无菌PBS洗两次。

　　(2)加入0.25%胰酶l.oml，置于37oC、5%C02孵箱中孵育l一3min。

　　(3)镜下观察细胞变圆时，加入含10%FBS的 RPMI1640培养液 1oml使胰酶失活。

　　(4)吹打细胞后，将细胞悬液吸出转入15ml离心管中。

　　(5)将离心管在室温下离心， 800rmpXsmin，吸去上清。

　　(6)在离心管中加入新鲜 RPMI1640培养液 1ml以重暴细胞，并计数。

　　(7)于离心管中继续加入 RPMI1640培养液，将细胞浓度调整为ZXlo6zml待用。

　　2.将MCF一7和MCF一 7/ADM细胞吹匀后分别注入无菌Eppendorf管中，每管lml。

　　3.每管加入罗丹明123(l.omg/ml)spl(终浓度为5“g/ml)，37OC、5%tCO:孵箱中孵育60min。

　　4.室温下离心，1500rmpxZmin，弃上清。

　　5.PBS液洗2遍后，用 lmlPBS重新悬浮细胞并移入流式管中。

　　6.流式细胞仪用488nm激发光测定各组细胞荧光强度。

　　7.实验重复3次。

　　(五)人参皂贰R婉影响MCF一7lADM细胞mdrl基因表达的实验

　　1.MCF一7和MCF一 7/ADM细胞的准备

　　(l)取对数生长期细胞，当细胞长至培养皿的80%时，吸去培养液。使用15ml无菌PBS洗两次。

　　(2)加入0.25%胰酶 1.sml，置于37OC、5%C02孵箱中孵育l一3min。

　　(3)镜下观察细胞变圆时，加入含10%FBS的 RPMI1640培养液 1oml使胰酶失活。

　　(4)吹打细胞后，将细胞悬液吸出转入15ml离心管中，并计数。

　　2.将McF一7和McF一7/ADM细胞吹匀后分别种入25。mZ培养瓶中，每瓶细胞数应)lxl护细胞。

　　3.每瓶再加入含10FBSRPMI1640培养液，使培养液量为10ml,375%COZ孵箱中孵育24h。

　　4.用Trizol提取细胞总RNA

　　(l)将培养瓶中的培养液弃去，加入适量的Trizol，吹打后移入Eppendorf管中。确保细胞完全裂解，液体基本澄清。

　　(2)将上述Eppendor增室温静置 1smin，加入氯仿(200林 l/lmlTrizol)，振荡，室温静置一omin，4℃， 12oooXg，离心lomin。

　　(3)小心吸取上层水相置于另一个新的无菌EpPendor增中，加入异丙醇(500林l八 mlTrizol)，上下颠倒混匀，室温静置10min，4，C， 12000Xg，离心lomin。弃上清。

　　(4)用80%乙醇(lml八mlTrizol)洗沉淀，4oC， 750oXg，离心smin，弃上清。重复此操作一次，吸净乙醇，将Eppendor增口朝下倾斜放在无菌吸水纸上，室温静置15一ZOmin，使沉淀自然干燥。

　　5.RNA定量

　　(1)将RNA沉淀溶于DEPC处理的DDW中，取适量稀释50倍后于分光光度计260nm处读数。

　　(2)按下式计算RNA浓度:RNA(林 g/ml)=40X0D26。 X50(稀释倍数)

　　(3)计算取2林gRNA所需各标本体积。其余RNA标本·80℃保存备用。

　　6.以RNA为模板，RT.PCR扩增目的基因mdri和内对照p一actin(l)盯实验(总体系20卜l)

　　①配制如下反应体系，置于PE一9600型PCR仪中，“℃，smin，然后立即置于冰上。

　　②在反应体系中加入以下试剂，置于PE一9600型PCR仪中10mill。

　　③将以上体系置于PE一9600型PCR仪中，42oC，3min;加入 SuperseriPt111卜1(20ou)。42oC，60min;然后75oC， 1smin。

　　④加入 RnaseHI林l(Zu)，37℃，20min。

　　⑤反应所得eDN^加入DEPe处理的DDwso林l，使之成为 100林l，一20oC保存备用。

　　(2)引物设计(表1)

　　(2)荧光定量PCR反应

 

　　(六)MCF一7和MCF一7lADM细胞P一gp蛋白表达的实验

　　1.将MCF一7和MCF一7/ADM细胞消化、吹匀后分别种入6孔板中，每孔1Xlo6细胞。

　　2.每孔再加入含10%FBS的 RPMI1640培养液lml，37OC、5%C02孵箱中孵育24h。

　　3.吸去培养液，每孔使用2ml无菌PBS洗两次。

　　4.每孔加入0.25%胰酶0.sml，置于37oC、5%COZ孵箱中孵育l一3min。

　　5.镜下观察细胞变圆时，每孔加入含10%FBS的RPMll“0培养液Zm使胰酶失活。

　　6.吹打细胞后，将细胞悬液吸出转入流式管中，并计数，每组细胞数应妻IXlo6。

　　7.4oC离心，800xg，smin，弃上清。

　　8.PBS洗细胞两次，800xg，smin，弃上清。

　　9.每管加入用pE(R·phyeoe仔thrin)标记的鼠xgo，或同型对照20协l。

　　10.经室温避光孵育30min后上流式细胞仪检测。

　　11.实验重复3次。

　　(七)统计学分析

　　实验结果以x士s表示，两组之间比较采用t检验，P<0.05为具有显著性差异。

　　结果

　　一、MCF一7和MCF一7/ADM的 ADMICS。的差别。

　　结果显示，MCF一7/ADM的ADMIC。明显高于MCF一7，两者相差约58倍(表2，图2)。

　　二.MCF一7和MCF一7/ADM细胞内罗丹明123荧光表达的差别。

　　培养体系加入等量罗丹明123后，流式细胞仪结果显示，MCF一7细胞内的罗丹明123荧光强度为97.67士 1.01%，MCF一7/ADM细胞为 1.22士0.20%。MCF一7显著高于MCF一7/ADM，两者相差约80倍(图3、4)。

　　三、MCF一7和MCF一7/ADM细胞mdrlmRNA表达的差别。

　　RT-PCR电泳图显示，MCF一7/ADM细胞 mdrlmRNA高表达，而MCF一7/ADM细胞mdrl mRNA无表达(图5)，旦一aetin为内对照

　　四、McF一7和McF一7lADM细胞P一gp表达的差别。

　　流式细胞仪结果显示，MCF一7和MCF一7/ADM细胞P一gp表达有差别，MCF一7/ADM细胞明显高于MCF一7细胞(图6、7)。

　　讨论

　　本实验中，我们将亲代乳腺癌细胞MCF一7暴露于浓度呈梯度递增的阿霉素(ADM)中，经过逐步长期诱导培养(浓度梯度诱导法)，历时6个月，筛选出MCF一7的耐药细胞株MCF一7/^DM[’4，151。MCF一7/ADM的最终培养条件为含有o.smg/L阿霉素的10%FBS的 RPMI1640培养液。MTT实验结果显示阿霉素对MCF一7及MCF一7/ADM的ICS。分别为l.12pM和65.43协M，两者相差58.42倍，从而验证了MCF一7/ADM细胞对阿霉素的耐药性。P一即可以与荧光染料罗丹明123特异性结合，从而将罗丹明123从细胞内转移至细胞外，此过程与P-gp转运抗肿瘤药物的机制相同，而罗丹明123因本身发荧光易于检测。因此可以应用细胞内罗丹明123留滞实验阐明P一gp介导的细胞耐药机制及药物逆转耐药作用机理「6]。我们进行的罗丹明123留滞实验显示:培养液中加入等量罗丹明123后，MCF一7细胞内的罗丹明123荧光强度为97.67%，而MCF一7/ADM细胞内的罗丹明123荧光强度仅为1.22%，此结果充分说明MCF一 7/ADM细胞内存在P一gp耐药途径。在接下来的 mdrlmRNA表达及P一gp表达实验中，MCF一7/ADM细胞显示出 mdrlmRNA及P一gp高表达，与MCF一7细胞相比有显著差异，更直接从转录和翻译水平证明MCF一7/ADM细胞对阿霉素的耐药性是由于P一gp过度表达而产生的[’7]。通过阿霉素诱导培养及一系列验证实验，我们建立了一个机制主要是MDRI基因过度表达导致细胞内药物浓度减少而产生MDR的乳腺癌耐药细胞系体外模型，此耐药细胞株的建立为进一步研究多药耐药的发生机制和研究逆转耐药方法提供了理想的实验工具。