胃癌早期诊断生物标记物研究

　　胃癌是常见恶性肿瘤之一，在世界范围内为第二多发恶性肿瘤，是消化系统最多发肿瘤。可能是胃癌临床的异质性表现，迄今为止胃癌尚缺乏理想的肿瘤标志物，从而也给其早期诊断、术后疗效评价、预后监测及胃癌患者的康复等造成了一定的困难。

　　表面加强激光解吸电离飞行时间质谱（Surface?enhanced laser desorption/ionization time?of?flight ma ectrometry,SELDI?TOF?MS）是近年来发展起来的一种全新的蛋白质组学研究手段，其基本原理是通过特定的化学表面结合蛋白质分子再以激光轰击，使蛋白质成为离子而飞行于电场中并被检测器所测得，进而用不同位置、强度的峰来表示各种不同的蛋白质及其相对含量，最终形成可用于分析的图谱。该方法克服了传统蛋白质组学研究方法所存在的诸多问题，实现了质谱技术用于临床检测的飞跃。

　　本研究应用SELDI质谱仪及其配套蛋白质芯片检测了34例胃癌患者和30例健康人的血清蛋白质指纹图谱，以筛选可用于临床胃癌早期诊断的特异性生物标记物。

　　1资料和方法

　　1.1资料 2004年1月～8月间我院收治的初诊胃癌患者34例，中位年龄52岁（34～74岁）。常规根治手术后按UICC 1997年胃癌 PTNM分期法进行分期，其中Ⅰ期患者6例，Ⅱ期6例，Ⅲ期5例， Ⅳ17例，诊断均经术后病理证实。健康人群来自我院经胃镜取材并经病理证实的无胃部疾病的30例，中位年龄49岁（25～72岁）。所有血样均于清晨空腹采集，静置离心分离血清，－80℃低温冰箱保存。

　1.2主要仪器、软件及试剂 ?Ⅱ表面加强激光解吸电离?飞行时间质谱仪（SELDI?TOF?MS）、能量吸收分子A、CM10型蛋白质芯片及相应分析软件ProteinChip Software 3.2.1（美国Ciphergen公司）；HEPES缓冲盐（Sigma公司）；CHA缓冲盐（Sigma公司）。

　1.3方法 CM?10 芯片（弱阳离子+疏水膜）

　1.3.1步骤 用HPLCH2O洗涤芯片，400r/min，震荡5min三次。先将10mM/L HCL倒入带盖试管中盖好后。震荡5min。在用去离子水冲洗数次，再将芯片装入HPLCH2O试管中震荡5min。将芯片架子，胶垫超声清洗干净，用去离子水冲洗数次晾干后，将芯片装入处理器上。每孔加入200μl 0.1M NaAC 结合buffer,室温振荡250r/min,5min重复一次。甩干后再上样品。

　1.3.2样品处理 ①血清样品冰上溶解，4度离心10 000r/min，5min。取上清20μl加入30μl U9(含DTT)混匀，4度震荡250/min,20min,每孔用封口膜封好。②U1配法：100μl U9(含DTT)+900μl 50 mMHepes pH 7.0。③每孔加入100μl U1缓冲液混匀，盖严振荡250r/min，30min。④从上述150μl 变形样品中取出50μl,加入到200μl 0.1M NaAC 结合buffer 中混匀，取出100μl 上样，室温振荡250r/min,60min,取出样品。⑤每孔加入150μl 0.1M NaAC buffer,室温振荡250r/min,5min,倒掉后加入150μl NaACbuffer,共3次。再用1mM Hepes pH 4.0 淋洗芯片30s,重复一次。除去芯片晾干。⑥将A高速离心30s,在A管中，加入200μl乙腈，200μl 1% TFA充分振荡5min，静止5min。离心1 000r/min 1min。⑦每孔加入A 0.5～1.0μl/点，重复一次。两次之间各点风干。

　1.3.3芯片检测 用加有All?in?one标准蛋白质的20芯片校正质谱仪，在Ciphergen ProteinChip软件中设定读片程序读取芯片数据。计算机以每秒1×109Hz的速度获得原始数据并快速精确地绘制出蛋白质质谱图。其中纵坐标为蛋白质相对含量，横坐标为蛋白质质荷比。

　1.3.4蛋白质质荷比 结合A后的蛋白质在SELDI?TOF?MS氦氖激光器的激光轰击下电离，带有电荷的蛋白质在加速电场的作用下，不同质荷比的蛋白质在长度一定的真空管中飞行所需的时间不同，蛋白质的质荷比（M/Z）与电离飞行时间的平方成正比。由E=UZ=1/2mv2；t=L/v推出M/Z=Kt2=(2U/L2)t2。其中Z为离子所带电荷数，U为电压，v为飞行速度，L为加速飞行电场电压，K为常数。

　1.3.5蛋白质相对含量 带有正电荷的蛋白质离子束在到达检测器的一瞬间，电子倍增器将产生的瞬时电流（瞬时电流It=Q/t，其中Q为t时刻检测器检测到的电荷数）转换成蛋白质的相对含量。

　1.4数据收集及统计学分析 质谱仪参数设定：激光强度190，灵敏度9，数据收集范围1 500～20 000m/z（蛋白质质量和电荷比值，以下简称质荷比）。原始数据先以Proteinchip Software 3.2.1软件校正，使总离子强度及分子量达到均一，并过滤噪音，初始噪音过滤值5，二次噪音过滤值2，以8%为最小阈值进行聚类。经上述数据预处理后，比较胃癌患者与健康人血清蛋白质质谱数据（由Proteinchip Software 3.2.1自带的Biomarker Wizard 5.0软件完成），用数据树方法对目标对象进行分类，对数据分组及相关性性进行分析。寻找两组之间表达有差异的蛋白质峰，结合各个峰的权重比较不同蛋白质峰排列组合的判别分析结果，选出最佳排列组合，最后同时输出原始判别和交叉验证的结果。

　2结果

　2.1生物标记物的发现 用Biomarker Wizard软件和Proteinchip Software软件分析34例胃癌患者和30例健康人血清中蛋白质的组成，结果发现2 046m/z、3 179m/z、1 817m/z、1 725m/z和1 588m/z等5个蛋白质组成的生物标记物可将正常人与胃癌患者准确的分组。用这个生物标记物分析数据共产生7个终节点，见图1：其中1、2、5、7均为只包含胃癌患者，共34例，满足≤1.475（M2046）、≤2.239(M3179)、≤1.321(M1817)(括号代表相应蛋白质相对含量，下同)为终节点1，满足≤ 1.475（M2046）、≤2.239(M3179)、>1.321（M1752）m/z、≤ -0.856（1817）为终节点2，满足≤1.475（M2046）、>2.239(M3179)、>1.798（M1929）为终节点5，满足>1.475（M2046）、>-0.697（M1817）为终节点7；终节点3、4、6为正常人，共30例，满足≤1.475（M2046）、≤2.239(M3179)、>1.321（M1752）、>-0.856（1817）为终节点3，满足≤1.475（M2046）、>2.2397(M3179)、≤1.798（M1929）为终节点4，满足>1.475（M2046）、>-0.697（ M1817）为终节点7。错误分组率为1.67%。

　2.2胃癌患者与健康人的比较 通过对34例胃癌患者和30例健康人血清蛋白质质谱数据的比较，判别分析显示其中5个蛋白质峰组合所构建的诊断模型（模型Ⅰ）能达到最佳诊断效果：2 046m/z、3 179m/z、1 817m/z、1 725m/z和1 588m/z，其中质荷比为2 046m/z的蛋白质峰如图1所示，可见正常人质荷比为2 046m/z的蛋白质含量明显低于胃癌患者，经方差分析，差异有显著性（lt;0.05）。原始判别的准确率为93.75%（60/64），特异度94.1%（32/34）， 灵敏度93.3%（28/30），见表1；交叉验证的准确率为76.56%（49/64），特异度73.5%（25/34）， 灵敏度80.0%（24/30），见表2。交叉验证显示模型Ⅰ对34例胃癌患者中的25例做出了准确预测。表1 模型Ⅰ原始判别的结果（

　2.3Ⅰ/Ⅱ期与Ⅲ/Ⅳ期胃癌患者的比较 比较12例Ⅰ/Ⅱ期患者与22例Ⅲ/Ⅳ期患者的质谱数据，其中4 665m/z 的单个蛋白质峰的诊断模型（模型Ⅱ）可达到鉴别Ⅰ/Ⅱ期与Ⅲ/Ⅳ期患者的最佳效果。原始判别，总准确率94.1%（32/34），特异度91.7%（11/12）， 灵敏度95.4%（21/22）；交叉验证结果，特异度91.7%（11/12），灵敏度86.4%（19/22），总准确率88.2%（30/34）。

　3讨论

　胃癌的诊断手段正从症状、临床体检、胃镜检查等经典手段向基因诊断、分子生物学检测手段发展，但作为后者重要组成部分之一的胃癌血清肿瘤标志物，近年来发展较缓，不能满足临床实际应用的需要。运用SELDI?TOF?MS技术来分析鉴定肿瘤不同于非肿瘤的蛋白质表达谱的全貌，从而获得内因、外因共同作用下肿瘤发生发展的较完整信息，正是针对目前研究现状的不足之处做出的有益尝试，该方法已成功应用于卵巢癌以及前列腺癌。在胃癌方面的研究也偶见报道。

　　判别分析是一种根据观察或测量到的若干变量值，来判断研究对象如何分类的常用统计分析方法，是应用计算机进行疾病辅助诊断的主要统计学基础。其基本原理是根据已知的分类（如属于胃癌组或是属于健康人组）和表明特征的变量值（即各蛋白质峰的峰值数据）建立判别函数，再将某个个体的自变量值回代到判别函数，得出判别分数或计算属于各类的概率，从而判断该个体属于哪一类。本研究过程中的判别分析主要分两个步骤进行，即原始判别和交叉验证。前者是将所有病例的峰值数据建立函数，再逐一将每个病例代入函数进行判别；后者则是利用除了某一病例外的其余所有病例的数据建立函数，再把这一未参与函数构建的病例数据代入函数进行判别，如此判别每一个病例。这种交叉验证的方法在统计学上称为“留一法”，与原始判别相比更为真实、稳定、可靠，所以我们选择了交叉验证的结果作为最终结果。

　　本研究运用SELDI?TOF?MS蛋白质芯片技术，得出了胃癌患者不同于健康人的血清蛋白质指纹图谱，应用判别分析筛选出能达到最佳诊断效果的蛋白质峰组合并建立诊断模型Ⅰ，交叉验证结果较满意，其灵敏度和特异度均远高于现有的各种肿瘤标志物，具有一定的诊断价值，筛选出的差异表达蛋白质将有可能成为新的候选肿瘤标志物。通过比较其对不同分期胃癌患者的诊断准确率可见，该模型对Ⅰ、Ⅱ期患者的诊断能力不亚于对Ⅲ、Ⅳ期的诊断，提示本方法在胃癌早期诊断方面有一定价值，所筛选出的候选肿瘤标志物也将有可能用于早期检测。而上文所提及的几种现有标志物，目前仅认为其在胃癌复发和转移的监测中有一定参考价值，而对早期诊断的价值则较低。比较Ⅰ/Ⅱ期患者和Ⅲ/Ⅳ期患者质谱数据构建的模型Ⅱ（单个蛋白质峰4 665m/z），能够较为准确的区分某一个胃癌患者是Ⅰ/Ⅱ期还是Ⅲ/Ⅳ期，有助于早期诊断、改善预后，同时对术前治疗及手术方式的合理选择也具有一定的参考价值。

　　需要指出的是，运用判别分析建立诊断模型的基本思路是选择具有最佳诊断效力的蛋白质峰组合而不是评价单个蛋白质峰的诊断效力；所得到的最佳组合也并非诊断效力由高到低排列的各个峰的简单叠加。因此，利用这一方法筛选候选肿瘤标志物时，不能仅局限于最佳诊断组合中所列出的几个蛋白质，而应该着眼于所有表达差异具有统计学意义的蛋白质。

　　综上所述，SELDI?TOF?MS技术在胃癌的诊断尤其是早期诊断、候选肿瘤标志物的筛选及术前分期等方面具有一定的价值。进一步的研究仍在进行中。

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