人参单体Rh2 诱导人肺腺癌A549/ DDP细胞凋亡的体外研究

　　人参单体Rh2 诱导人肺腺癌A549/ DDP细胞凋亡的体外研究

　　周东波　胡成平　苏晓丽　杨红忠

　　作者单位:长沙,中南大学湘雅医院呼吸内科

　　出处：中国肺癌杂志2005 年8 月第8 卷第4 期

　　Chin J Lung Cancer , August 2005 , Vol . 8 , No. 4

　　【摘要】　背景与目的　肺癌已成为人类癌症主要死亡原因之一。从植物中开发抗肿瘤药物是国内外抗肿瘤新药开发的一个热点。本研究的目的是观察人参单体Rh2 诱导人肺腺癌A549/ DDP 细胞系凋亡的作用,并探讨其可能的分子机制。方法　体外培养的人肺腺癌A549/ DDP 细胞经不同浓度梯度的人参单体Rh2干预,分别应用MTT 实验观察其对细胞增殖的影响,用流式细胞术检测细胞周期、凋亡指数及相关基因表达的改变,以及用双抗体夹心EL ISA 法测定细胞上清液sApo21/ Fas 浓度变化。结果　①人参单体Rh2 可抑制A549/ DDP 细胞的生长,并呈剂量、时间依赖作用。②人参单体Rh2 处理A549/ DDP 细胞24 h ,实验组凋亡指数显著高于对照组( P < 0. 001) ,G0 / G1 期细胞比例显著高于对照组( P < 0. 01) ,S 期细胞比例显著低于对照组( P < 0. 01) , G2 / M 期细胞比例与对照组比较无显著性差异( P > 0. 05) 。③实验组p53 、Fas 阳性表达率显著高于对照组( P < 0. 01 , P < 0. 001) ,Bcl22 阳性表达率显著低于对照组( P < 0. 001) 。④实验组A549/ DDP细胞培养上清液于不同时间sApo21/ Fas 含量均显著低于对照组( P < 0. 05) 。

　　结论　人参单体Rh2 具有诱导

　　人肺腺癌A549/ DDP 细胞凋亡的作用,其分子机制可能是上调p53 和Fas 及下调Bcl22 的表达、通过Fas/FasL 系统途径诱导细胞凋亡。

　　【关键词】　人参单体Rh2 　　肺肿瘤　　A549/ DDP 细胞株　　凋亡

　　【中图分类号】　R285. 5 ;R734. 2

　　Study on apoptosis of human lung adenocarcinoma cell line A549/ DDP induced by ginsenoside Rh2 in vit ro

　　Z HOU Dongbo , HU Cheng ping , SU X iaol i , YA N G Hongz hong . Department of Res pi ratory Medicine ,Xiangy a Hos pi tal , Cent ral S outhern Uni versi t y , Changsha , Hunan 410008 , P. R. China

　　Corres ponding author : HU Cheng ping , E2mai l : hucheng p28 @hotmai l . com

　　【Abstract】　Background and objective 　Lung cancer is one of the leading causes of cancer2related death in mankind. To exploit antitumor drug f rom plant has been a highlight at home and abroad. The aim of this study is to investigate the apoptosis of human lung adenocarcinoma cell line A549/ DDP induced by ginsenoside Rh2( G2Rh2 ) and to explore it s possible molecular mechanism. Methods 　The growth inhibition effect of G2Rh2 on A549/ DDP cells was evaluated by MTT assay. Cell cycle analysis , apoptosis index and tumor related gene ex2 pression were detected by flow cytomet ry. The changes of sApo21/ Fas level in the cell culture supernatant were determined by EL ISA method. Results 　① G2Rh2 significantly inhibited the growth of A549/ DDP cells in a dose2time2de2pendent manner. ② Af ter 24 hours’t reatment with G2Rh2 , apoptosis index of t rial group was significantly higher than that of cont rol group ( P < 0. 001) . The proportion of cells in G0/ G1 phase in t rial group was much higher than that in cont rol group ( P < 0. 01) , while proportion in S phase in t rial group was markedly lower than that in cont rol group ( P < 0. 01) . There was no significant difference in proportion in G2/ M phase between t rial group and cont rol group ( P > 0. 05) . ③ The positive expression rate of p53 and Fas in t rial group was significantly higher than that in cont rol group ( P < 0. 01 , P < 0. 001) , while the positive ex2 pression rate of Bcl22 in t rial group was significantly lower than that in cont rol group ( P < 0. 001) . ④ The level of sApo21/ Fas in A549/ DDP cell culture supernatant in t rial group was remarkably lower than that in cont rol group ( P < 0. 05) . Conclusion 　G2Rh2 can induce the apoptosis of A549/ DDP cells. It s molecular mechanism may be up2regulating expression of p53 and Fas and down2regulating expression of Bcl22.

　　【Key words】　Ginsenoside Rh2 ( G2Rh2 ) 　　Lung neoplasms 　　A549/ DDP cell 　　Apoptosis

　　肺癌是我国乃至世界发病率最高的恶性肿瘤。随着以铂类为一线药物的方案在晚期非小细胞肺癌化疗中的广泛应用,肺癌对铂类的耐药已成为目前关注的热点。大多数化疗药物,无论单独还是联合,对晚期非小细胞肺癌疗效均不佳,且毒副反应大,因此寻求新的化疗药物和逆转耐药药物已成为目前研究的热点。从植物中开发抗肿瘤药物,是国内外抗肿瘤新药开发的一个热点。现代医学研究发现人参单体皂甙Rh2(ginsenoside Rh2 , G2Rh2 ) 具有较强的抗肿瘤生物活性,研究表明它对卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、神经胶质瘤等肿瘤细胞的生长具有明显的抑制作用[ 1～4 ] 。但关于G2Rh2 对肺癌细胞的作用以及用于治疗肺癌的研究国内外尚未见报道。本实验以人肺腺癌A549/DDP 细胞株为受试对象,研究G2Rh2 的凋亡诱导作用,旨在进一步阐明中药人参抗肿瘤作用的机制,为其应用于肿瘤的临床治疗提供更多的实验依据,报道如下。

　　1 　材料与方法

　　1. 1 　材料　A549/ DDP 细胞为采用恒定药物浓度、周期性作用的体外诱导法反复筛选建成的一株耐顺铂的细胞系,由中科院生物所生物大分子国家重点实验室提供。G2Rh2 由吉林大学基础医学院生化研究室提供。四甲基偶氮唑蓝(MTT) 为美国Sigma 公司产品。碘化丙啶(PI) 购自华美生物制剂公司。流式细胞仪型号为Coulter Epics AL TRa Hpper sort System ( 美国) 。CO2 细胞培养箱为美国SHELLLAB 公司产品。人Fas EL ISA 试剂盒购于晶美生物(北京) 有限公司。

　　1. 2 　方法

　　1. 2. 1 　细胞培养传代　将A549/ DDP 细胞置于含5 % CO2 、37 ℃的饱和湿度培养箱中,在RPMI1640 培养液(含有12 %胎牛血清、青霉素100 U/ ml 、链霉素

　　100 mg/ L) 中培养,0. 25 %胰蛋白酶消化传代,取对数生长期的细胞进行实验。

　　1. 2. 2 　MTT 实验　分别接种A549/ DDP 细胞悬液于96 孔板,每孔2 ×104 个细胞,24 h 后A549/ DDP 细胞中加入G2Rh2 , 药物浓度分别为0. 1 ～1 000μmol/ L ;并设对照组,对照组中加入等体积的RPMI1640 标准培养液。每种浓度设3个复孔,将96孔培养板在培养箱中培养24 、48 、72 h ,观察细胞形态变化。然后各孔分别加入MTT 溶液(5 g/ L) ,每孔10μl ,继续在培养箱中培养4 h 后弃去上清,每孔加入DMSO (二甲基亚砜) 溶液100μl , 震荡后室温静置10 min ,使其充分溶解,然后用酶标仪于570 nm 处测定吸光度(A) 值,计算细胞生长抑制率。抑制率≥50 %为对该药物敏感。

　　1. 2. 3 　流式细胞仪检测细胞周期变化、凋亡指数及相关基因蛋白表达　用G2Rh2 50μmol/ L 处理对数生长期A549/ DDP 细胞24 h ;并设对照组,对照组中加入等体积的RPMI1640 标准培养液。经0. 25 %胰蛋白酶消化后, 收集1 ×106 个细胞, PBS 缓冲液洗涤,5 min ×3 次。70 %冷乙醇4 ℃固定,于碘化丙啶一步

　　染色液中染色后做流式细胞仪分析。激发波长为488 nm ,发射波长为530 nm。实验重复2 次。通过相关软件拟合出细胞周期各时相比例及凋亡指数。并用PBS 洗细胞5 min ×3 次,分别加入兔或鼠抗人p53 、Fas 以及Bcl22 抗体, 37 ℃孵育30 min , PBS 洗细胞5 min ×3 次,加入羊抗兔或鼠FITC2IgG 100μl ,37 ℃孵育30 min ,PBS 洗细胞5 min ×3 次,离心过滤,用流式细胞仪检测细胞p53 、Fas 以及Bcl22 蛋白的表达。

　　以荧光标记细胞为阳性细胞,计算阳性率。

　　1. 2. 4 　细胞培养上清液sApo21/ Fas 检测

　　用G2Rh2 50μmol/ L 分别处理对数生长期A549/ DDP 细胞24 、48 、72h ; 并设对照组, 对照组中加入等体积的RPMI1640标准培养液。取细胞培养上清液,双抗体夹心EL ISA 法测定其sApo21/ Fas 水平,严格按照试剂盒说明步骤进行。主要步骤:酶标板每孔(抗人Fas单抗已包被于酶标板上) 加100μl 标准品(浓度分别为0 、31. 25 、62. 5 、125 、250 、500 、1 000 、2 000 ng/ L) 或样品,室温孵育120 min ,洗板4 次,再加入生物素化的抗人sApo21/ Fas 抗体和辣根氧化物酶标记的亲和素,室温孵育120 min ,洗板4 次,加入显色剂100μl/ 孔,避光室温20 min , 加入终止液100 μl/ 孔后变黄, 在450 nm处测OD 值, Fas 浓度与OD450 值之间呈正比,通过绘制标准曲线求出标本中Fas 浓度。

　　1. 2. 5 　统计学处理　统计学方法采用χ2 检验、配对t检验及one2way ANOVA 方差分析,用SPSS10. 0 统计软件包处理。

　　2 　结果

　　2. 1 　G2Rh2 对A549/ DDP 细胞的细胞毒作用　不同浓度的G2Rh2 干预A549/ DDP 细胞24 、48 、72 h 后,倒置显微镜下观察。镜下可见对照组细胞呈梭形或多边形生长,细胞透亮,折光性好,状态佳。A549/ DDP细胞系在0. 1μmol/ L 剂量组细胞形态无明显改变;而在中剂量组(1～50μmol/ L) 细胞数目减少,细胞形态欠规则,呈梭形或少许圆形贴壁生长,胞浆内变化不明显或略有变化,细胞形态变化随着药物浓度增加、作用时间延长而更加明显;高剂量组(100μmol/ L 及以上)

　　细胞折光性差,明显增大,轮廓模糊,胞内空泡增多,部分细胞已坏死,漂浮于培养液中。MTT 检测结果显示其抑制作用随药物浓度增加、作用时间延长而增强,呈现剂量、时间依赖作用,经统计学检验差异有显著性

　　( P < 0. 01) (表1) 。

　　表1 　不同浓度G2Rh2 对A549/ DDP 细胞的生长抑制率( n = 3 , % , . x ±s)

　　Tab 1 　The growth inhibition rate of A549/ DDP cells induced

　　by G2Rh2 of different concent ration ( n = 3 , % , . x ±s)

　　Concent ration of

　　G2Rh2 (μmol/ L)

　　Time

　　24 h 48 h 72 h

　　0(Control group) 0 0 0

　　0. 1 12. 38 ±3. 68 3 15. 45 ±2. 33 3 18. 78 ±4. 34 3

　　1 16. 45 ±3. 21 3 △ 23. 67 ±6. 32 3 ▲ 30. 46 ±5. 11 3

　　10 26. 35 ±5. 24 3 △ 30. 44 ±4. 87 3 ▲ 35. 56 ±1. 78 3

　　20 34. 57 ±4. 36 3 △ 40. 93 ±5. 39 3 ▲ 45. 45 ±2. 66 3

　　50 39. 68 ±6. 23 3 △ 50. 36 ±3. 64 3 ▲ 54. 86 ±1. 89 3

　　100 49. 44 ±5. 48 3 △ 57. 48 ±4. 35 3 ▲ 64. 39 ±6. 22 3

　　1000 60. 36 ±7. 82 3 △ 70. 37 ±5. 30 3 ▲ 78. 44 ±3. 56 3

　　3 : P < 0. 01 vs cont rol group ; △: 24 h group vs 48 h group , P < 0. 05 ;▲: 48 h group vs 72 h group , P < 0. 05

　　2. 2 　G2Rh2 对A549/ DDP 细胞系凋亡水平和细胞周期的影响　实验组A549/ DDP 细胞凋亡指数38. 51 %显著高于对照组5. 76 %( P < 0. 001) 。实验组G0 / G1

　　期细胞比例77. 6 %显著高于对照组67. 3 % ( P <0. 01) ,S 期细胞比例11. 3 %显著低于对照组24. 5 %( P < 0. 01) ,G2 / M 期细胞比例11. 1 %与对照组8. 2 %

　　比较无显著性差异( P > 0. 05) 。

　　2. 3 　G2Rh2 对A549/ DDP 细胞系凋亡相关基因阳性表达率的影响　实验组A549/ DDP 细胞p53 阳性表达率35. 5 %显著高于对照组27. 8 %( P < 0. 01) , Fas

　　阳性表达率70. 4 %显著高于对照组20. 5 % ( P <0. 001) ,Bcl22 阳性表达率36. 8 %显著低于对照组55. 4 %( P < 0. 001) 。

　　2. 4 　G2Rh2 对A549/ DDP 细胞系细胞培养上清液sApo21/ Fas 含量的影响　实验组A549/ DDP 细胞培养上清液于不同时间的sApo21/ Fas 含量均显著低于

　　对照组( P < 0. 05) (表2) 。

　　3 　讨论

　　研究发现,虽然大多数化疗药物都具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用,但化疗药物的毒副作用限制了其临床应用,而植物抗癌成份倍受人们关注。人参( Panaxginseng C. A. Meyer) 为五加科多年生草本植物,现代医学表明人参具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射等多种生物学活性[5 ] 。G2Rh2 属于二醇组皂甙,是由人参中提取的天然活性成分,近年来体内外实验证实,它可以通过诱导分化或凋亡抑制肿瘤细胞的增殖与生长,如卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、神经胶质瘤等,并证明其对正常组织毒性甚低,但G2Rh2 能否诱导人肺腺癌A549/DDP 细胞的凋亡,国内外尚未见报道。

　　表2 　G2Rh2 对A549/ DDP 细胞系细胞培养上清液sApo21/ Fas 含量的影响(ng/ L)

　　Tab 2 　The effect of G2Rh2 on the level of sApo21/ Fas

　　in A549/ DDP cell culture supernatant (ng/ L)

　　Group

　　Time

　　24 h 48 h 72 h

　　Cont rol group 15. 65 ±2. 13 16. 37 ±3. 45 18. 34 ±1. 25

　　Trial group 8. 64 ±1. 52 10. 66 ±3. 24 12. 74 ±2. 88

　　P value < 0. 05 < 0. 05 < 0. 05

　　本研究结果提示,G2Rh2 可诱导细胞形态学发生改变,诱导细胞凋亡,影响细胞的增殖活力,抑制其生长,且这一变化在实验范围内呈现剂量、时间依赖性作用。于广久等[6 ]观察了G2Rh2 对人喉癌细胞株Hep22 的抗增殖作用。

　　李殿友等[4 ] 在检测Rh2 对C6 胶质瘤细胞增殖率的实验中,不同浓度(2 、4 、8μmol/ L) 的Rh2 对C6 细胞的增殖抑制作用随剂量增加和时间延长而明显增强,台盼蓝排斥实验证实C6 细胞存活百分率不论实验组还是对照组均大于90 %,实验结果说明Rh2 可明显抑制体外C6 胶质瘤细胞的增殖,且在实验剂量范围内没有明显毒性。我们的实验结果与其报道相一致。近年来研究发现许多抗肿瘤药物作用于肿瘤细胞的G0 / G1 期。Lee 等[7 ] 用流式细胞仪检测G2Rh2 体

　　外抑制肝癌细胞SK2HEP21 增殖的实验表明, G2Rh2能够使细胞阻滞于G1 期,滞留于G1 / S 关卡处,阻止其向S 期发展。Ota 等[8 ] 也报道G2Rh2 能够使黑色素瘤细胞B16 发生G1 期阻滞,细胞周期的进行受阻。本实验用流式细胞仪检测也显示, G2Rh2 以细胞毒性作用不明显的剂量作用于A549/ DDP 细胞24 h 以后,实验组的凋亡指数明显高于对照组, G0 / G1 期细胞较对照组明显增多,而S 期细胞数目减少,提示G2Rh2对A549/ DDP 细胞的周期调控作用主要发生于G1

　　期,阻止其向S 期发展,可将细胞阻滞于G0 / G1 期,从而抑制其DNA 合成。

　　目前研究表明,诱导细胞凋亡的因素很多,不同的因素诱导细胞凋亡的信号传导途径不同[9 ] ,p53 、Fas、Bcl22 基因是较早确定的凋亡调节基因。肺癌的发生、发展与多种凋亡基因相关,如p53 缺失或表达异常,Fas、Bcl22 基因表达异常[ 10 ] 。为了探讨G2Rh2 的作用机制,我们检测了凋亡相关基因的阳性表达率。本研究实验组A549/ DDP 细胞p53 、Fas 基因阳性表达率较对照组升高,Bcl22 基因阳性表达率较对照组下降。因此我们推测G2Rh2 可能通过上调p53 和Fas 基因及下调Bcl22 基因而诱导A549/ DDP 细胞凋亡。]

　　Apo21/ Fas 是一种细胞表面诱导凋亡的分子,也称为CD95 ,相对分子量为44 600 ,系跨膜糖蛋白,属于肿瘤坏死因子受体( TNFR) 与神经生长因子受体(N GFR) 超家族成员,是一个细胞凋亡信号受体,可以诱导Apo21/ Fas 蛋白所在的细胞凋亡[11 ] 。正常肺泡细胞上皮及肺癌细胞中均有Fas 表达[12 ] ;Apo21/ Fas配体(Apo21/ Fas ligand , Apo21/ FasL) 是一种Ⅱ型跨膜蛋白,与TNFR 家族有同源性,Apo21/ FasL 主要表达于活化的T 细胞、N K 细胞表面。Apo21/ Fas 与Apo21/ FasL 结合是Apo21/ Fas 在体内发挥作用的唯一途径。Apo21/ Fas 受体有两种形式: 膜型Apo21/Fas ( mApo21/ Fas ) 和可溶型Apo21/ Fas ( sApo21/Fas) 。细胞表面的mApo21/ Fas 通过与Apo21/ FasL结合而激发Apo21/ Fas 阳性细胞凋亡,sApo21/ Fas 通过与Apo21/ FasL 竞争结合而抑制mApo21/ Fas 途径介导的细胞凋亡,因此可以认为sApo21/ Fas 与肿瘤细胞逃避免疫监视以及恶性肿瘤的演变有关[13 ] 。梁启廉等[ 14 ] 研究发现58 例肝癌患者化疗后有效患者血清sApo21/ Fas 浓度明显低于化疗前。本实验应用G2Rh2 不同时间干预A549/ DDP 细胞后,细胞培养上清液sApo21/ Fas 含量均显著低于对照组,说明G2Rh2可通过Fas/ FasL 系统途径诱导肺腺癌细胞凋亡。

　　综上所述, 人参单体Rh2 具有诱导人肺腺癌A549/ DDP 细胞凋亡的作用,其分子机制可能是上调p53 和Fas 及下调Bcl22 的表达、通过Fas/ FasL 系统途径诱导细胞凋亡。

　　参　考　文　献

　　1 　Ota T , Maeda M , Odashima S , et al . G1 phase2specific suppres2 sion of t he Cdk2 activity by ginsenoside Rh2 in cultured murine cells.Life Sci ,1997 ,60 (2) ∶PL39244.

　　2 　Tode T , Kikuchi Y, Kita T , et al . Inhibitory effect s by oral ad2minist ration of ginsenoside Rh2 on t he growt h of human ovarian cancercells in nude mice. J Cancer Res Clin Oncol ,1993 ,120 (122) ∶24226.

　　3 　Zhou GH , Meng Y, Li Y, et al . Study of inhibitory effect s of Gin2 senoside Rh2 on cultured PC23M cell . J N Bet hune Univ Med Sci ,2001 ,27 (6) ∶5952597. [ 周桂华,孟艳,李扬,等. 人参单体皂甙Rh2 对体外培养的前列腺癌细胞株PC23M 抑制效应的研究. 白求恩医科大学学报,2001 ,27 (6) ∶5952597. ]

　　4 　Li DY, Yang H , Luo YN. Inhibition of growt h and induced of ap2 optosis of Ginsenoside Rh2 on cult ured C6 glioma cells. J N Bethune Univ Med Sci ,2000 ,26 (4) ∶3422344. [李殿友,杨红,罗毅男.人参单体皂甙Rh2 对C6 胶质瘤细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用.白求恩医科大学学报,2000 ,26 (4) ∶3422344. ]

　　5 　Zhang J T. Ret rospection and prospection of Ginseng researth. Acta Pharmaceutica Sin ,1995 ,30 ∶321. [ 张均田. 人参研究的回顾和展望. 药学学报,1995 ,30 ∶321. ]

　　6 　Yu GJ , Kang J , Guo F. Anti2proliferative effect and t he mecha2 nism of Ginsenoside Rh2 on human laryngeal carcinoma cell line Hep22.J Jinzhou Med College ,2003 ,24 (6) ∶34237. [ 于广久,康健,郭凤. 人参单体皂甙Rh2 对人喉癌细胞株Hep22 抗增殖作用的研究. 锦州医学院学报,2003 ,24 (6) ∶34237. ]

　　7 　Lee KY, Park JA , Chung E , et al . Ginsenoside2Rh2 blocks t he cell cycle of SK2HEP21 cells at t he G1/ S boundary by selectively inducing t he protein expression of p27kip1. Cancer Let t ,1996 ,110 (122) ∶193_200.

　　8 　Ota T , Kohno H , Maeda M , et al . Involvement of peanut aggluti2 nin2binding sugar chains in experimental metastasis of B16 mela2noma cells. Oncol Res ,1993 ,5 (627) ∶2352243.

　　9 　Kim HJ , Lee KJ . Heat shock and ceramide have different apopto2 tic pat hways in radiation induced fibrosarcoma ( RIF) cell s. Mol Cell Biochem ,2002 ,229 (122) ∶1392151.

　　10 　Minna JD , Fong K, Zochbauer2Muller S , et al . Molecular pat ho2 genesis of lung cancer and potential t ranslational applications. Cancer J ,2002 ,8 (Suppl 1) ∶S412S46.

　　11 　Nagata S , Golstein P. The Fas deat h factor . Science , 1995 , 267 (5203) ∶144921456.

　　12 　Fine A , Anderson NL , Rot hstein TL , et al . Fas expression in pul2 monary alveolar type Ⅱcells. Am J Physiol ,1997 ,273 (1 Pt 1) 13 　Cascino I , Papoff G, De Maria R , et al . Fas/ Apo21 (CD95) recep2 tor lacking t he int racytoplasmic signaling domain protect s tumor cells f rom Fas2mediated apoptosis. J Immunol ,1996 ,156 (1) ∶13217.

　　14 　Liang QL , Pan DC , Yin ZM , et al . Effect of serum soluble Apo21/ Fas in patient s wit h hepatocellular carcinoma after chemot herapy and it s clinical significance. Chin J Clin Oncol ,2002 ,29 (4) ∶2342240. [ 梁启廉,潘达超,银正民,等. 化疗对肝癌患者血清可溶性Apo21/ Fas 水平的影响及其临床意义. 中国肿瘤临床,2002 ,29 (4) ∶2342240. ]

　　(收稿:2004207226 　　修回:2004209229)