人参皂甙Rh2对食管癌Eca-109细胞caspase3、caspase8基因的影响

　　目的: 探讨人参皂甙Rh2诱导人食管癌Eca-109细胞凋亡过程中caspase3、caspase8凋亡调节基因的相互关系及可能的作用机制.

　　方法: 应用MTT法测定其对细胞的生长抑制作用, 流式细胞术分析人参皂甙Rh2作用后胞凋亡及增殖的变化, 应用免疫细胞化学及Western blot技术检测用药前后凋亡相关基因caspase3、caspase8蛋白表达的变化.

　　结果: 人参皂甙Rh2对人食管癌Eca-109细胞有生长抑制作用, 并呈时效和量效依赖关系.流式细胞仪分析结果发现, 食管癌Eca-109细胞在DNA组方图上出现典型的亚二倍体峰即凋亡峰, 在细胞周期中的分布也发生了明显的变化, 其48 h凋亡率明显高于对照组(19.10%±2.12% vs 2.10%±0.87%, P <0.01). 免疫细胞化学及Western blot技术结果显示, 20 mg/L人参皂甙Rh2作用72 h后食管癌Eca-109细胞caspase3、caspase8蛋白表达明显升高(0.35±0.04 vs 0.10±0.02, 0.84±0.06 vs 0.31±0.11,均P <0.05).

　　结论: 人参皂甙Rh2具有诱导食管癌Eca-109细胞凋亡和抑制细胞分化的作用, 其分子机制

　　可能是上调caspase3、caspase8蛋白表达.关键词: 人参皂甙Rh2; 食管癌Eca-109细胞; 凋亡;caspase3; caspase80

　　引言 人参是我国传统的名贵药材, 人参中含有多种类型的化学成分[1], 人参皂甙具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射等多种生物学活性, 其中人参皂甙单体Rh2(ginsenoside-Rh2, GS-Rh2)是从人参中分离出的原人参二醇型低糖链皂甙单体, 多项研究证实, GS-Rh2、Rg3抑制癌细胞的能力最强[2-6], 并且对正常细胞的毒性甚低. GS-Rh2可以通过诱导细胞凋亡或分化, 有效地抑制多种肿瘤细胞的增殖活性[7-10], 对食管癌细胞的作用研究报道在国内外尚少见. 本研究通过体外培养食管癌Eca-109细胞, 研究GS-Rh2作用后细胞凋亡及其调控基因表达的变化, 探讨GS-Rh2在食管癌细胞中的作用机制, 为食管癌的化学预防提供实验依据.

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　人食管癌细胞株Eca-109, 由中国人民解放军第四军医大学实验中心提供.GS-Rh2吉林大学基础医学院有机化学教研室, RPMI 1640购自美国Gibco公司, 二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司, 胎牛血清购自天津灏洋生物公司, 考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所, 聚偏二氟乙烯膜(PVDF)购自美国Milipore公司, caspase3兔抗人多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司进口分装,caspase8鼠抗人单克隆抗体购自美国Abcam公司, SP试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司. Epics-XL-Ⅱ型流式细胞仪, 美国BeckmanCoulter公司, LDZ5-2型离心机, 北京医用离心机厂, CO2培养箱, 日本SANYO公司, DG5031型酶联免疫检测仪, 华东电子集团医疗装备公司.

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞实验及分组: 食管癌细胞株Eca-109用含100 mL/L胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基常规培养. 正常传代, 随机分为不加药的对照组及用5、10、20、40 mg/L的人参皂甙Rh2处理24、48、72 h组, 分别收获细胞进行相关实验.

　　1.2.2 细胞的生长抑制: 取对数生长期的人食管癌Eca-109细胞, 用0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化, 细胞计数, 接种于96孔培养板中, 每孔滴加单细胞悬液200 μL, 培养细胞完全贴壁生长后, 加药GS-Rh2(0、5、10、20、40 mg/L), 培养24、48和72 h. 同时设不含药物的阴性对照组和等体积DMSO的溶剂对照组, 每浓度每时间点设6组, 每孔滴加MTT溶液(5 g/L)20 μL, 继续孵育4h, 吸弃上清液. 每孔滴加DMSO 200 μL, 酶联免疫检测仪测定, 绘制细胞生长曲线.

　　1.2.3 FCM检测细胞凋亡和周期变化: 用5、10、20、40 mg/L的GS-Rh2处理细胞24、48、72 h后终止培养, 分别收获细胞. 采用碘化丙啶(propidiumiodide, PI)一步插入性DNA荧光染色方法.DNA染液中含PI 50 mg/L、RNA酶10 mg/L及1%Triton-X 100. 先用0.01 mol/L PBS离心洗涤2次,去除样品中的70%乙醇. 每份样品中加入DNA染液1 mL, 在4 ℃冰箱中染色30 min. 上机检测前以500目筛网过滤, 应用流式细胞仪进行检测.根据亚G1峰的分布组方图计算细胞凋亡率. 应用DNA细胞周期分析软件, 计算出DNA组方图各时相分布的百分比.

　　1.2.4 免疫细胞化学检测: 将细胞接种到预先放置了消毒盖玻片的6孔板, 置CO2培养箱孵育, 进行细胞培养. 20 mg/L的GS-Rh2处理细胞分别培养24、48、72 h后终止培养, 每组6孔细胞, 取出盖玻片, 浸入0.01 mol/L PBS洗涤3次, 每次3 min.加冷丙酮于室温固定10 min, 分别对caspase3、caspase8的表达进行检测. 按SP试剂盒操作说明进行. DAB显色后每张切片取10个高倍视野, 每个视野大约20个细胞, 采用图像分析软件ImageproPlus 5.0分析积分吸光度值(IA ), 以平均值作为最终结果. 1.2.5 Western blot检测细胞凋亡基因蛋白的表达: 收集细胞, PBS洗涤2次, 加入200 mL蛋白裂解液, 冰浴1 h, 4 ℃ 10 000×g 离心20 min, 吸取上清液, 考马斯亮蓝试剂盒测定蛋白浓度.-70 ℃保存. 每份取30 μg细胞总蛋白进行10%变性蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳, 电泳后, 转至PVDF膜, 37 ℃用5%脱脂奶粉封闭2h, 加入一抗caspase8、caspase3(1∶200稀释),β-actin(1∶200稀释), 加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或小鼠IgG(1∶5 000稀释), 37℃孵育2 h, 洗膜后加入ECL发光试剂, 在X线胶片上曝光, 显影, 定影. Western blot图片应用凝胶成像系统(美国UVP公司)测定光密度值, 目的基因与β-actin光密度值的比值作为其基因的相对含量.统计学处理 实验数据均用mean±SD表示,采用SPSS11.5统计软件进行统计分析, 两组间均数比较采用t 检验, 检验水准α = 0.05.

　　2 结果

　　2.1 MTT法测定细胞生长抑制 结果显示GS-Rh2对Eca-109细胞有生长抑制作用, 其抑制作用随药物浓度增加、作用时间延长而增强, 呈现时效和量效关系, GS-Rh2对细胞生长的半数抑制浓度(IC50)为20 mg/L(图1).

　　2.2 流式细胞仪分析细胞凋亡和细胞周期 GSRh2能诱导Eca-109细胞发生凋亡, 凋亡率随浓度的增高及时间的延长而明显升高, 与对照组相比, 差异有显著性(P <0.05). GS-Rh2将Eca-109细胞阻滞于G0/G1期, 随着浓度的增高及作用时间的延长, G0/G1期细胞数逐渐增加, S和G2/M期细胞数逐渐减少. 与对照组比较, 差异具有统计学意义(P <0.01或0.05), 有明显的量效及时效关系(表1).

　　2.3 免疫细胞化学检测 caspase3、caspase8蛋白阳性物质主要位于细胞质. 采用图像分析软件Image-pro Plus 5.0分析阳性区域IA 值, 对照组中,caspase3和caspase8蛋白在细胞中表达于20 mg/LGS-Rh2处理后表达水平明显降低, 差异具有统计学意义(P <0.05),

　　2.4 Western blot检测细胞凋亡基因蛋白的表达与不加药的对照组进行比较, 药物作用24 h后蛋白表达开始发生明显变化, caspase8、caspase3蛋白表达水平增高(P <0.01或P <0.05). 而且随着药物作用时间的延长, 有明显的时效关系(图4,表3).

　　3 讨论

　　大量的研究表明, 虽然大多数化疗药物都具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用, 但化疗药物的不良

　　反应限制了其临床应用, 而植物抗癌成分越来越受到人们关注, 人参具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射等多种生物活性作用[11-14]. 人参抗肿瘤的活性成分主要是人参皂甙, GS-Rh2是由人参中提取的天然活性成分, 属于二醇组皂甙. 可直接作用于癌细胞, 通过诱导其凋亡抑制肿瘤的生长. 自从Odashima等[15]报道了从红参中提取的有效成分Rh2在体外对鼠黑色素瘤B16细胞具有分化诱导作用后, 各国学者先后通过多种体内外实验证实[16], Rh2可以通过诱导分化或凋亡, 抑制多种肿瘤细胞的增殖与生长, 并证明对正常细

　　胞的毒性甚低. Fei等[17]研究发现人参皂甙Rh2诱导黑色素瘤细胞A375-S2凋亡的机制部分依赖于caspase-8和caspase-3通路. 李殿友等[18]2000年发表文章首次报道了Rh2对C6胶质瘤细胞的增殖影响, 在该实验中发现: Rh2作用72 h后, 浓度为4 μmol/L的Rh2对C6胶质瘤细胞诱导凋亡作用最为明显. 日本学者研究发现Rh2在体外浓度为10-60 μmol/L间能够以剂量依赖方式抑制各种已知的人类卵巢癌细胞株的增殖, 并且在IC50浓度左右导致细胞凋亡[19]. Kim等[20]研究发现GSRh2诱导人神经母细胞瘤SK-N-BE(2)细胞凋亡过程中, 需要caspase1和caspase3的激活和Bax的表达增加. 本研究通过体外培养食管癌Eca-109细胞, 观察GS-Rh2对其细胞凋亡的影响, 以及细胞凋亡相关调控因子caspase8和caspase3基因表达的变化, 以探讨其抗癌作用的机制. 结果表明GS-Rh2能够抑制Eca-109细胞的增殖, 并且呈现出明显的时效和量效关系, 结果与GS-Rh2在其他肿瘤中的作用类似[21-29], 是GS-Rh2抗肿瘤机制的理论基础之一.近年来研究发现许多肿瘤药物作用于肿瘤细胞的G0/G1期, 本实验用流式细胞仪分析细胞凋亡和细胞周期, 结果显示GS-Rh2能诱导Eca-109细胞发生凋亡, 凋亡率随浓度的增高及时间的延长而明显升高. 随着浓度的增高及作用时间的延长, G0/G1期细胞数逐渐增加, S和G2/M期细胞数逐渐减少. 提示GS-Rh2将Eca-109细胞阻滞于G0/G1期, 从而抑制其DNA合成. 我们的实验结果与其他报道相一致[30-33].本研究观察并检测了GS-R h2作用前后Eca-109细胞中细胞凋亡调控因子caspase8和caspase3蛋白的表达, 结果显示20 mg/L GS-Rh2处理细胞后caspase8和caspase3基因表达水平增高, 而且有较明显的时效关系, 这与在其他肿瘤细胞系中的研究结果类似, 可能通过启动细胞凋亡信号传导系统, 凋亡信号通过细胞质信号蛋白传递至细胞凋亡的执行者caspase, 再由激活的caspase对其特异性底物进行降解, 最终caspase3的活化导致细胞DNA的裂解造成细胞凋亡[34,35].进一步证实了caspase8-caspase3通路在细胞凋亡中的重要作用.总之, 本研究为阐明GS-Rh2的抗癌机制, 指导临床应用GS-Rh2治疗食管癌及其他恶性肿瘤提供实验依据.