人参单体皂苷Rh2抑制缺氧条件下人视网膜血管内皮细胞增殖及整合素αvβ3 表达的研究

　　〔摘　要〕　目的　探讨人参单体皂苷Rh2对缺氧条件下人视网膜血管内皮细胞生长及整合素(integrin) αvβ3表达的影响。方法　建立人视网膜血管内皮细胞缺氧模型,并给予其不同浓度的人参单体皂苷Rh2,应用MTT法观察人参单体皂苷Rh2对人视网膜血管内皮细胞增殖的影响;应用流式细胞术检测人视网膜血管内皮细胞凋亡的情况;用RT-PCR检测对Integrinαv和β3基因的表达。结果　MTT结果显示,缺氧对照组细胞增殖活性明显强于正常对照组(P<0.05);缺氧细胞加用Rh2后的增殖明显受到抑制,与缺氧对照组比差异具有显著性(P<0.05);流式细胞结果显示,加用Rh2后的细胞凋亡率与缺氧对照组比无显著性差异(P>0.05)。RT-PCR结果表明,和正常对照组比,缺氧对照组的细胞Integrinαv和β3基因的表达明显增强, Rh2可显著下调Integrinαv和β3基因表达。结论　人参单体皂苷Rh2在缺氧条件下能明显抑制人视网膜血管内皮细胞的生但无明显诱导凋亡的作用。

　　〔关键词〕　人参单体皂苷Rh2;整合素αvβ3;增殖;凋亡

　　研究表明,整合素在血管生成中起着关键作用,其中尤以整合素αvβ3与新生血管生成的关系最为密切。整合素αvβ3选择性地表达于新生血管内皮细胞中,与配体结合后通过丝裂原激活的蛋白激酶途径使内皮细胞增殖,分化和迁移形成血管,但在正常细胞中不表达。人参单体皂苷Rh2具有提高机体免疫力,抗病毒等功效,主要用于抗肿瘤方面的研究。近年来,其抗血管生成方面的作用逐渐引起人们的关注。实验表明:人参单体皂苷Rh2通过抑制内皮细胞增生使肿瘤缺乏新生血管网的供应而无法生长和转移。但尚未见人参单体皂苷Rh2抑制视网膜微血管内皮细胞增生报道。本研究旨在探讨人参皂甙对人视网膜新生血管内皮细胞生长的影响。

　　1　材料与方法

　　1.1 材料

　　人参单体皂苷Rh2,由本校基础医学院药物化学教研室提供,系由西洋参中提取,纯度 >99.5%; 噻唑蓝(MTT)购自Sigma公司。人视网膜血管内皮细胞株(humanret2inal capillaryendothelial cells,HRCEC)为本实验室冻存,细胞在IMDM培养基(Gibico公司) , 10%胎牛血清(Hycolon公司)条件下培养。

　　1.2 HRCEC缺氧模型的建立及分组

　　选用第3～6代HRCEC进行实验。待细胞长满瓶底后,用橡皮塞密封培养瓶口,插入两个中枪头作为进气及排气孔,将输液用滴管通过进气孔向瓶内充入5%CO295%N2 混合气体(0.5kg/cm2) ,持续30min,使瓶内处于相对缺氧状态,再放入5%CO2孵箱中继续培养。HRCEC来自于吉林大学中日联谊医院前列腺研究中心实验室。实验共分四组:正常对照组,缺氧对照组,两个加药组即缺氧联合低剂量人参单体皂苷Rh2组(5mg/L)及缺氧联合高剂量人参单体皂苷Rh2组(10mg/L)。

　　1.3 细胞生长抑制实验

　　用相差显微镜观察比较不同加药组和对照组细胞的形态变化。用MTT法检测细胞生长抑制率:细胞缺氧模型建立后,取对数生长期的后三组细胞以每孔1×104的浓度接种于96孔培养板。培养24h后向两个加药组加药,每组设4复孔,分别于加药24 h, 48 h, 72 h后加MTT(5g/L)15μl,继续孵育4 h后每孔加150μl DMSO,震荡10min,用酶标仪测定570 nm时各孔光吸收值(A值)。计算细胞生长抑制率,抑制率≥30%为细胞对该药敏感。

　　细胞生长抑制率(%) =〔(1-加药组A值) /缺氧对照组A值〕×100%

　　1.4 细胞凋亡及周期检测

　　将细胞缺氧模型建立后的后三组细胞经0.25%胰酶消化后传代接种于培养瓶中,每瓶细胞1×106,24h后加药,Rh2终浓度为5mg/L和10mg/L,对照组加等体积PBS,各瓶终体积为4ml, 24h后,收集三组细胞,用冷PBS(pH7.2)清洗2次, 70%的冷乙醇4 ℃固定24 h。用FACStarpous流式细胞仪检测,计算凋亡率和各期细胞所占比例。G1峰前出现的亚2倍体峰即为凋亡峰,比G1期细胞DNA含量少的细胞确定为凋亡细胞,同时观察细胞周期变化。

　　1.5　RT2PCR

　　建立细胞缺氧模型, 24 h后向后两组细胞加药,继续培养24h后收集全部四组细胞,按Trizol操作说明,提取RNA,紫外分光光度计定量。以GAPDH为内参, RNA样品经逆转录反应合成cDNA,然后进行PCR扩增。Integrinαv扩增产物为574 bp, 上游引物为: 5′-CCAAAGCAAACACCAC2CCAG-3′,下游引物为: 5‘-TTGAAATCTCCGACAGCCAC-3′。Integrinβ3 扩增产物为250 bp ,上游引物为: 5′-TGACAATCAT2TACTCTGCCTCC-3′, 下游引物为: 5′-ACGCACTTCCAGCTC2TACTTT-3′。GAPDH扩增产物为309 bp,上游引物为: 5′-GG2GAAACTGTGGCGTGAT-3′下游引物为: 5′-AAAGGTGGAG2GAGTGGGT-3′。PCR产物经1%琼脂糖凝胶系统电泳(含溴化乙啶) ,拍照鉴定和分析。

　　1.5 统计学处理

　　采用SPSS1110统计软件对数据进行处理,使用χ2检验进行统计分析。

　　2.结果

　　2.1　对细胞生长状态的影响

　　各组HRCEC加药24h后光镜下观察:正常对照组细胞呈梭形贴壁,铺满整个瓶壁。缺氧组细胞亦呈梭形贴壁,但生长速度明显加快,可在24h内铺满整个瓶壁。加药组细胞部分呈圆形贴壁,培养液中漂浮有细胞和细胞碎片,细胞数较对照组明显减少,且高剂量用药组的细胞状态比低剂量用药组更差(见图1)。

　　2.2　Rh2对HRCEC增殖的影响

　　MTT结果显示：与缺氧对照组相比,高剂量及低剂量的人参单体皂苷Rh2对HRCEC均有生长抑制作用,并呈明显剂量依赖性,二者间差异显著(P<0.05) , 5mg/L人参单体皂苷Rh2给药组生长抑制率为34.1%,而10mg/L人参单体皂苷Rh2给药组生长抑制率为52.3%,二者比较差异具有显著性(P<0.05)。见图2。

　　2.3　Rh2对HRCEC凋亡的作用

　　流式细胞检测结果显示:与缺氧对照组相比,不同剂量的给药组细胞均被不同程度地阻滞在G2-M期,差异显著(P<0.05) ,且高剂量组细胞周期抑制率明显高于低剂量组。缺氧对照组G2-M期抑制率为20.16%,低剂量给药组G2-M期抑制率为38.75%,高剂量给药组G2-M期抑制率为52.36%。但凋亡率各组之间无显著差异(P >0.05) ,缺氧对照组凋亡率为1.31%,低剂量给药组凋亡率为1.93%,高剂量给药组凋亡率为2.36%(见图3)。

　　2.4　RT2PCR检测Rh2对Integrinαv和β3mRNA表达的影响

　　电泳结果显示: Integrinαv、β3 及GAPDH的扩增片段大小与设计的完全一致。缺氧对照组与正常对照组相比, Integrinαv和β3mRNA表达水平有明显提高,而各用药组与缺氧对照组比较Integrinαv和β3mRNA表达水平明显降低,差异显著(P<0.05) (见图4)。

　　3　讨　论

　　视网膜新生血管形成是个极其复杂的过程,通常认为当视网膜缺血缺氧时,在各种生长因子及细胞因子的刺激下,已经存在的微血管网内皮细胞发生有丝分裂、迁移,以出芽的方式形成管腔。因此内皮细胞增生是其关键步骤。如能有效地打断这一环节,新生血管将无法形成。本实验结果表明,人参单体皂苷Rh2在体外同样能有效地抑制HRCEC增生,从而为人参单体皂苷Rh2体内抑制视网膜新生血管形成提供了研究基础。

　　Integrin是一类细胞表面受体家族,由α和β两条链通过非共价键连接而成的异源二聚体跨膜糖蛋白。这一类受体参与细胞与基质,细胞与细胞之间的黏附,在很多重要的生理过程中起重要作用。迄今为止发现23种Integrin亚型,其中Integrinαvβ3在新生血管内皮细胞有高度表达, αvβ3 与配体结合后通过丝裂原激活的蛋白激酶途径使内皮细胞增殖,分化和迁移形成血管。因此, Integrinαvβ3逐渐被认为是新生血管组织的标记物。已有实验证明缺氧可诱导Integrinαvβ3 表达的增高,而缺氧调节αvβ3基因的表达是血管形成的重要调节因子。尽管众多资料显示Integrin与血管生成密切相关,但其确切机制尚不清楚,可能与生长因子受体激活途径相整合,与蛋白激酶C(PKC) ,Ras癌基因蛋白/sh2包含蛋白/促分裂素原活化蛋白激酶(Ras/shc/MAPK) ,成簇黏附激酶(FAK)等信号分子相互作用,调节细胞骨架和血管生成相关基因以及血管内皮细胞整合素受体的表达,影响内皮细胞和细胞外基质的相互作用,导致血管生成的发生和维持,或血管的消退、凋亡,从而影响血管内皮细胞的生长或消退。

　　本研究结果表明,通过建立缺氧模型并人为给予不同剂量的人参单体皂苷Rh2,在体外能明显抑制HRCEC的增殖和生长,且呈明显的剂量依赖性。可能是人参单体皂苷Rh2通过抑制Integrinαvβ3 在HRCEC的表达,使细胞阻滞在G2-M期,从而达到抑制HRCEC增殖的作用。但对凋亡的诱导作用却并不明显,可能是我们所研究的细胞并非肿瘤血管内皮细胞的缘故,其机制尚待进一步深入研究。

　　综上所述,本实验结果证明了人参单体皂苷Rh2具有抑制HRCEC增殖和生长的作用,这为其在临床视网膜静脉阻塞、眼缺血综合症、增殖性糖尿病视网膜病变等眼缺血缺氧性疾病的治疗提供了一定的实验基础和理论依据。因人参单体皂苷Rh2是从人参中提取的天然产物,毒副作用小,更具安全性。