如何实现胰腺癌的早期诊断？

　　胰腺癌因胰腺特殊解剖特征和早期非特异性症状，80%～85%的患者在最初评估时就被诊断为转移性或局部进展性疾病，失去了手术机会。目前胰腺癌的诊断依赖于CA19-9、CA125等肿瘤标志物及影像学检查，确诊时间相对滞后，导致病情延误。最近的全基因组测序研究表明，胰腺癌中有12个核心信号通路发生了基因改变，且初始突变可能出现在任何症状前近20年，这为临床医师利用精确的手段对胰腺癌进行早期检测带来可能。液体活检是指对血液、尿液、唾液等体液进行微创取样和分析，以检测和量化循环的癌症生物标志物来进行诊断和预后判断。液体活检作为一种通过患者体液样本了解疾病动态的微创方法，是精确肿瘤学领域的一种创新工具，可以克服目前组织活检的局限性，比组织活检更快速、更容易重复，能实时提供有关癌症的信息，在癌症诊断、预后判断和监测方面越来越受欢迎。胰腺癌受益于早期发现，所以在体液中寻找新的生物标志物有很大的发展前景。本文就血清、尿液、唾液、胰液、胆汁、十二指肠液液体活检中的生物标志物进行综述。

 

　　一、血清

 

　　血清中生物标志物的相关研究有很多，主要基于基因组学和蛋白质组学领域相关研究进展。

 

　　1.基因组学：微小RNAs（microRNAs, miRNAs）是一种长度为20～24个核苷酸的非编码RNA，具有癌症特异性表达模式。有研究表明miR-205联合CA19-9优于单独CA19-9的诊断准确性，其作为胰腺癌液体活检标志物具有很高的潜力；miRNA-10b的精确定量可以鉴别胰腺癌与慢性胰腺炎。外泌体是一种膜包裹的囊泡，由包括癌细胞在内的多种细胞不断大量地分泌并携带肿瘤特异性分子，广泛存在于体液中。由于其相对稳定性和组成涵盖了包括蛋白质、代谢物、DNA、DNA修饰、编码和非编码RNA在内的所有癌症相关生物标志物，成为一种强大的诊断工具。Li等分析了胰腺癌患者血浆外泌体中CIRC-PDE8A的表达，发现外泌体CIRC-PDE8A与胰腺癌患者的进展和预后相关，可能是胰腺癌早期诊断或预测病情进展的有用标志物。Kitagawa等则发现外泌体中mRNA WASF2、ARF6及sonRNA SNORA74A和SNORA25可能是早期发现胰腺癌的有效工具，且WASF2水平与胰腺癌风险的相关性最高。体液中肿瘤来源的循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）经美国FDA批准临床应用，目前被广泛应用于辅助诊疗非小细胞肺癌患者。Kinugasa等比较分析了75例胰腺癌患者组织DNA和ctDNA的K-ras基因突变，发现58例K-ras基因突变率一致，且ctDNA中K-ras突变的患者生存率明显降低，表明ctDNA分析是一种新的检测胰腺癌突变的有效方法。循环无细胞DNA（circulating cell-free DNA，cfDNA）是肿瘤衍生部分，其5-羟甲基胞嘧啶信号在胰腺癌中有特异性改变，可用于识别癌症类型和跟踪肿瘤分期。血液样本中cfDNA总量可区分健康者与胰腺导管内乳头状黏液瘤（intraductal papillary mocinous neoplasm，IPMN）或胰腺癌患者，且IPMN患者cfDNA中有GNAS突变，而浆液性囊腺瘤或健康者无此突变，故cfDNA分析可用于诊断IPMN患者或监测疾病进展，有望实现胰腺癌前病变的超早期诊断。超敏液滴数字聚合酶链反应二次定量检测及上皮细胞黏附分子脂质磁性球和质体单克隆抗体分离系统捕获cfDNA的效率高，可为胰腺癌的早期诊断提供强有力的技术支撑。

 

　　2.蛋白质组学：碱性磷酸酶胎盘样2蛋白（alkaline phosphatase placental like-2，ALPPL-2）是一种癌胚蛋白。Dua等发现ALPPL-2在许多胰腺癌细胞系的mRNA和蛋白水平上均有异常表达，在胰腺癌早期诊断中具有潜在应用价值。肿瘤生物标志物的早期检测敏感性受限于肿瘤内生物标志物的表达、脱落率及早期肿瘤的体积。较小的肿瘤可能不会流失足够数量的生物标志物，但是少量具有突变、过表达或不完全分区的肿瘤相关蛋白可引起体液免疫反应，特异性自身抗体很容易被检测到。肿瘤相关抗原自身抗体可在诊断前数月至数年出现，有望作为早期检测的生物标志物。Bracci等的研究表明胰腺癌相关宿主免疫反应因子可能是诊断筛查工具和预后指标。可溶性iC3b是在自身抗体与肿瘤细胞结合后，通过与补体调控蛋白的相互作用而导致补体级联失活后生成的，其诊断胰腺癌相较于CA19-9灵敏度更高，监测术后复发可比影像学诊断早4个月。Wang等发现血清中巨噬细胞抑制因子1对早期胰腺导管腺癌诊断及鉴别诊断的灵敏度比CA19-9更好，且可用于术后复发的检测。此外，血清NGAL、MMP-9、LAMC2、ANXA2、ADAM9等也有可能成为胰腺癌的早期标志物。

 

　　二、尿液

 

　　CA19-9是临床常用的肿瘤标志物，在胰腺癌的早期诊断中，常与其他肿瘤标志物如CEA、CA50、CA242等联合应用。受此启发，Szajda等设想有些标志物可能涉及糖结合物加工过程中的酶，并在初步研究中表明，尿液中的HEX 、GAL 、FUC和MAN等溶酶体外糖苷酶的活性可用于胰腺癌的早期诊断。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL）是近年来出现的一种在多种肿瘤发生中起重要作用的蛋白。各种恶性肿瘤的NGAL始终过表达，与肿瘤大小、分期和侵袭性有关。这些特征使NGAL成为潜在的恶性肿瘤生物标志物。Hogendorf等研究发现，截断值为27 ng/ml的尿液NGAL浓度的灵敏度和特异度不逊于甚至略高于CA125和CA19-9，可以准确鉴别慢性胰腺炎肿块和胰腺癌。Debernardi等对胰腺癌、慢性胰腺炎患者及健康对照者的尿液样本中miRNA谱进行分析，发现miR-143、miR-223、miR-30e在I期胰腺癌显著过表达，首次证明了miRNA生物标志物在尿液样本中无创、早期检测方面的应用。除检测尿液中相对特异、敏感的分子标志物，检测尿液代谢谱也可能成为一种有效的无创筛选手段。Davis等使用OPLS-DA对66种代谢物的光谱进行有针对性的定性分析，检测到胰腺癌与健康对照组和良性胰腺疾病的代谢谱存在明显差异。Napoli等还将尿液代谢谱和磁共振波谱结合起来，不仅能识别胰腺癌复杂的分子特征，还显示了跟踪疾病演变和进行肿瘤定位的可能性。上述研究表明，尿液的分析有一定的可靠性和可发展性，其无创和非侵入性可能有助于大规模的筛查程序，值得更进一步的研究。

 

　　三、唾液

 

　　唾液是一种易于获取和提供信息的生物液体，是早期发现多种疾病的理想选择，包括心血管、肾脏和自身免疫性疾病、病毒和细菌感染，更重要的是癌症。Sugimoto等对口腔癌、胰腺癌、乳腺癌等患者的唾液样本进行了全面的代谢产物分析，对比发现唾液代谢物中含有癌症特异性特征。循环肿瘤外泌体含有丰富的肿瘤生物学信息，已成为肿瘤早期检测和诊断的重要靶点，唾液中就含有大量的循环外泌体。有研究表明，唾液外泌体中miR-1246和miR-4644有可能成为胰腺癌的潜在生物标志物。Zhang等通过对唾液上清液进行转录组分析发现，唾液中K-ras、MBD3L2、ACRV1、DPM1 4个mRNA标志物可以将胰腺癌患者与非癌性研究对象区分开来，特异度和灵敏度高。之前的研究结果显示，H19、HOTAIR、HOTTIP、MALAT1、PVT1 5种lncRNA与胰腺癌的关系最密切，Xie等发现胰腺癌组唾液中HOTAIR和PVT1的含量明显高于良性胰腺肿瘤患者和健康对照者唾液中的表达，显示出新的非侵入性生物标志物检测胰腺癌的潜力。唾液作为一种无创、安全的来源，在疾病的诊断和预后判断中有可能成为血液或其他侵入性诊断替代品。

 

　　四、胆汁、胰液、十二指肠液

 

　　1.胆汁：胆汁中含有丰富的生物分子，这些分子与肝脏、胆管、胆囊和胰腺密切相关，可作为肝、胆、胰腺等肿瘤生物标志物的丰富来源。Hogendorf等的临床试验同时发现在胆汁样本中截断值为27 ng/ml的NGAL在胰腺腺癌鉴别方面具有显著的准确性。K-ras密码子12突变是胰腺癌发生发展过程中最早的基因突变之一。Zhou等在大鼠实验中发现胆汁的K-ras基因第12外显子密码子的点突变具有较高的易变性和特异性，有望成为胰腺癌肝转移早期诊断的一种新元素筛选方法。

 

　　2.胰液：Ginesta等发现腺瘤性息肉病杆菌的甲基化分析对胰腺癌、壶腹癌、IPMN均有较高的敏感性，具有潜在的临床应用价值。胰液中循环的miRNAs可作为胰腺癌的候选生物标志物，如Wang等认为胰液中循环miR-205、miR-210、miR-492和miR-1247水平升高是胰腺癌患者疾病和不良预后的候选生物标志物。Ateeb等则发现胰液中miR-155可能是胰腺癌前病变IPMN的临床生物标志物。目前影像学检查可以鉴别胰腺肿瘤与囊肿，但不能鉴别显微镜下的异型增生。胰液中的突变体T53的检测可用于提高胰腺癌和高级别异型增生的诊断和筛查。蛋白质组学分析发现MMP-9、DJ-1和AIBG是胰腺导管腺癌患者胰液中过表达的蛋白，在胰腺疾病的诊断和筛选中有进一步的应用价值。IPMN患者胰腺分泌的胰蛋白酶抑制剂（pancreatic secretory trypsin inhibitor，PSTI）水平明显高于其他胰腺疾病患者，检测PSTI水平可能实现胰腺癌前病变的超早期诊断。胆盐依赖型脂肪酶(bile salt dependent lipase，BSDL)基因11号外显子编码可变数量的串联重复序列参与胰腺病理改变，在胰液中检测截断的BSDL对PRAAHGc端序列抗体的反应可能是早期诊断胰腺癌的一个新工具。胰液获取的手段也在发展，内镜下鼻胰引流管可对胰腺癌患者进行重复胰液细胞学检查，具有较高的诊断率，尤其是对于长径＜20mm或位于胰头的肿瘤，具有一定的诊断价值。

 

　　3.十二指肠液：Matsunaga等发现十二指肠液中的S100钙结合蛋白P(S100P)浓度诊断0/ⅠA和ⅠB/ⅡA期胰腺导管腺癌的灵敏度和特异度分别为85%和77%，因此联合十二指肠液中S100P浓度和常规筛检，可促进胰腺癌的早期检测。

 

　　胆汁、胰液、十二指肠液的获取途径相较于其他体液可能不便利且有微创伤性，但人类胆汁、胰液、十二指肠液成分很大程度上局限于病理来源，循环的生物标志物和分泌物浓度高，相较于血液、尿液等可排除混杂的代谢因素，可能有更高的准确度、特异度和灵敏度。

 

　　综上所述，虽然关于胰腺癌生物标志物的相关研究很多，但仍缺乏大样本的临床研究和可靠的大数据，目前仍没有新的标志物被临床广泛应用，因此需要将胰腺癌早期诊断中具有潜在应用价值的生物标志物放到更多大规模研究中去验证。影像学和组织活检等传统的筛查手段都有一定的缺点，液体活检作为临床需要的辅助诊断技术应运而生，但液体中的生物标志物相对于组织含量低，需要开发液体活检后的相关检测技术来提高检测率。只有具备了敏感特异的生物标志物、简洁的筛查技术及高危人群筛查对象后，才能将简便易行的检查手段应用于体检筛查中，从而为胰腺癌的早期诊断和疾病监测提供更有价值的指导。

 

　　作者：吴雪君   来源：胰腺病杂志