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膀胱癌组织端粒酶活性表达及其与临床病理特征关系的研究

2009-07-31 抗癌健康网

专注健康 关爱生命

【摘要】 目的 探讨膀胱移行细胞癌(traitional cells carcinoma,TCC)组织端粒酶活性表达与膀胱癌临床病理特征的关系。方法 应用端粒酶重复序列扩增(telomeric repeat amplification protocol,TRAP)银染TRAP?ELISA方法检测25例膀胱癌组织(实验组)和4例膀胱正常组织(对照组)中端粒酶活性的表达,并与临床病理分期、病理分级及预后关系进行分析。结果 实验组中端粒酶活性表达率为96%,对照组无表达,实验组端粒酶活性高于对照组(P<0?001);端粒酶活性临床病理分期T2高于T1、T3高于T2(P<0?01),晚期组高于早期组(P<0?001);端粒酶活性病理分级G2高于G1、G3高于G2(P<0?01)。结论 实验组端粒酶活性高表达,并与膀胱癌临床病理分期、病理分级呈正相关,端粒酶激活可能在膀胱癌的发生及发展过程中起重要作用,端粒酶可作为膀胱癌早期诊断及判定预后的分子生物学标记。

【关键词】 膀胱肿瘤/ 酶学;癌;端粒;末端转移酶/ 生理学

  近年的研究表明,端粒酶活性在大部分肿瘤组织中表达,而在正常体细胞中不表达〔1〕。端粒酶激活是细胞永生及恶性转化的重要标志〔2,3〕。但端粒酶活性表达与泌尿系肿瘤临床生物学行为的关系及预后的意义,目前尚未完全明确;半定量检测膀胱移行细胞癌(traitional cells carcinoma,TCC)组织端粒酶活性表达,并与其临床病理特征关系的研究,目前国内尚未见报道。本研究采用端粒重复序列扩增?银染(TRAP?AgNO3)及TRAP? ELISA方法,检测膀胱癌组织及正常膀胱组织的端粒酶活性,并与临床病理分期、病理分级及预后的关系进行了分析。

  1 材料与方法

  1?1 标本收集 来自2000年9月~2001年9月在吉林大学第一医院泌尿外科手术切除的膀胱TCC新鲜冰冻标本25例,作为实验组。其中男19例,女6例, 44~74(平均60?76)岁,随访结果有2例死亡。其中1例为T2G2期肿瘤患者,术后13月死于心脏病,另1例为T4G3患者,术后10月死于肿瘤转移。4例正常膀胱组织作为对照组。上述标本均经病理证实,-80℃储存。按国际标准TNM分期法,临床病理分期(PTNM):T1 期9例,T2 期8例,T3 期5例,T4期3例。病理分级:G1级7例,G2 级12例,G3级6例。

  1?2 实验方法 用TRAP?AgNO3 及TRAP?ELISA方法检测端粒酶活性。按试剂盒说明书操作,试剂盒购自保铃曼公司。将组织放入裂解液中裂解30 min,加入胸腺嘧啶核苷酸合成酶(thymidylate synthetase,TS)引物,25℃孵育30 min,加入连接蛋白(coexin,CX) 引物,94℃,30 s,先破坏端粒酶活性,然后进行PCR扩增。具体条件为变性94℃,30 s;退火50℃,30 s;延伸 72℃,90 s,循环32次,最后72℃ 孵育10 min。①TRAP产物在含54 mmol/L Tris?HCl(pH8?0),0?54 mmol/L 硼酸,1?2 mmol/L EDTA的缓冲液中,在12%非变性聚丙烯凝胶上电泳,凝胶用5%AgNO3染色。阳性对照为试剂盒自带端粒酶阳性组织裂解液,阴性对照为未加入组织裂解液的体系。②TRAP产物与地高辛标记的端粒探针室温孵育60 min,C清洗,然后与抗地高辛第二抗体37℃孵育30 min,DAB 显色10 min,H2SO4 终止反应。酶标仪下分别测450及690 nm处吸光度A值。结果以样本吸光度A值=A450 nm?A690 nm表示,以样本吸光度A值?阴性对照吸光度A值,差值高于0?2&timeA450 nm?A690 nm为阳性。

  1?3 统计学处理 采用t检验。

  2 结果

  2?1 实验组端粒酶活性表达 TRAP?AgNO3染色分析显示,见图1。实验组有24例(96%)检测到端粒酶活性,对照组均为阴性。实验组端粒酶活性(1?340 2lusm0?330 3)明显高于对照组(0?047 5lusm0?006 6)(P<0?001)。

  1?阴性对照;2?T1G2;3?T2G1;4?正常组织;5?T3G2;6?T4G3;7?T4G2;8?阳性对照

  图1 端粒酶在膀胱癌组织中的表达(略)

  2?2 实验组端粒酶活性与临床病理分期、病理分级的关系 膀胱癌端粒酶活性在临床病理分期T2(1?393lusm0?042 0)高于T1(1?037lusm0?381 0)、T3(1?600lusm0?061 0)高于T2,两组比较均有显著差异(P<0?01),T4(1?68lusm0?065 6)高于T3,但两组比较无显著差异(P>0?05);晚期组(T3+T4:1?63lusm0?071 3)明显高于早期组(T1+T2:1?20lusm0?327 0)(P<0?001)。膀胱癌端粒酶活性在病理分级G2(1?42lusm0?13)高于G1(1?11lusm0?42)、G3(1?61lusm0?095)高于G2,组间比较均有显著差异(P<0?01)。

  3 讨论

  1989年Morin等〔4〕首先在人宫颈癌Hela细胞株中发现有端粒酶活性。膀胱TCC是端粒酶活性研究最多的泌尿系统肿瘤。膀胱癌组织端粒酶活性阳性率达86%~100%〔5,6〕。本研究结果显示,膀胱癌组织中端粒酶活性为1?340lusm0?330 3,阳性率为96%(24/25),正常膀胱组织不表达端粒酶活性,表明端粒酶的激活可能对膀胱癌的发生有重要意义。本研究结果还显示,在膀胱癌组织中,存在端粒酶活性为阴性的病例,提示端粒酶的激活并不是唯一维持和稳定端粒长度的因素,可能存在不依赖于端粒酶激活的途径。

  端粒酶活性在泌尿系肿瘤中的临床意义还不十分确定:Mehle等〔7〕检测了56例肾癌组织,发现端粒酶活性与肿瘤的临床分期、病理分级、预后无关。 Lin等〔6〕分析39例膀胱癌组织端粒酶活性与生物学行为的关系,发现病理分级G1、G2、G3级的端粒酶强阳性率分别为20%、62%、100%(P<0?005);临床分期TA~T1、T2~T4期的端粒酶强阳性率分别为46%、100%(P<0?05)。膀胱癌分为表浅性膀胱癌及浸润性膀胱癌,其生物学行为极其复杂。Koshida等〔8〕也指出端粒酶在泌尿系肿瘤中的诊断预后意义正在逐步被认识,表明端粒酶的激活可能对膀胱癌的发生、发展有重要意义,并且可以作为评价临床进展的一项重要指标

【参考文献】
  1 Kim NW,Piatyszek MA,Prose KR,et al?ecific aociation of human telomerase activity with immoral cells and cancer 〔J〕?Science,1994;266: 2011?5?

  2 Blackburn EH?Structure and function of telomere 〔J〕?Nature,1995;350: 569?73?

  3 Holt SE,Shay JW,Wright WE,et al?Refine the telomere?telomerase hypothesis of aging and cancer 〔J〕?Nature Biotechnol,1996;14: 836?9?

  4 Morin GB?The human telomerase terminal traferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats〔J〕?Cell,1989;59: 521?9?

  5 Heine B,Hummel M,Muller M,et al?Non?radioactive measurement of telomerase activity in human bladder cancer,bladder washings,and in urine 〔J〕?J Pathol,1998;184: 71?6?

  6 Lin Y,Miyamoto H,Fujinami K,et al?Telomerase activity in human bladder cancer 〔J〕?Clin Cancer Res,1996;2: 929?31?

  7 Mehle C,Piatyszek MA,Ljungberg B,et al?Telomerase activity in human renal cell carcinoma〔J〕?Oncogene,1996;13: 161?6?

  8 Koshida K,Imao T,Ito H,et al?Proects for molecular research in urological oncology: bladder cancer 〔J〕?Hinyokika Kiyo,2001;47(11): 815?8?

  

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