膀胱癌组织中MMP?2与TIMP?2的表达及相关性研究

【摘要】 　　目的: 研究基质金属蛋白酶?2（MMP?2）和金属蛋白酶组织抑制因子?2（TIMP?2）在膀胱移行细胞癌组织中的表达及其与膀胱癌侵袭、转移的关系。方法: 应用链霉菌抗生物素蛋白?过氧化酶(S?P)免疫组化方法, 检测5例正常膀胱组织和35例膀胱移行细胞癌组织中MM P?2 和TIMP?2的表达。结果:MMP?2、TIMP?2在膀胱正常组织中均呈阴性表达，而在35例膀胱癌组织中均不同程度的表达，阳性率分别为45.71%和51.43%。MMP?2随肿瘤病理分级和临床分期的增高而增高（P<0.05）,TIMP?2的表达变化与肿瘤病理分级和临床分期的无相关性(P>0. 05)。结论:MMP?2和TIMP?2相互作用对于膀胱癌的侵袭发展发挥了重要作用；MMP?2 可能对判断膀胱癌的预后有帮助。

【关键词】 膀胱移行性细胞癌； 基质金属蛋白酶?2； 金属蛋白酶组织抑制因子?2； 肿瘤侵袭

　　膀胱肿瘤是一类多中心、易复发及浸润性生长的肿瘤疾病, 早期发现具有浸润性倾向的浅表性肿瘤和可能发生转移的浸润性肿瘤, 对于选择合适的治疗方法和判断预后具有重要意义。然而,目前还没有合适的生物学标记物可以准确预测膀胱癌的预后, 因此大多数研究都在试图发现一些较特异的肿瘤标记物。本研究采用链霉菌抗生物素蛋白?过氧化酶(Streptavidin?Peroxidase, S?P )免疫组化方法对基质金属蛋白酶?2（Matrixmetalloproteinase?2, MMP?2）、金属蛋白酶组织抑制因子?2（tiue inhibitor of metalloproteinase?2,TIMP?2）在膀胱移行细胞癌组织中的表达及其与膀胱癌侵袭、转移的关系进行探讨。

　　1 资料与方法

　　1.1 临床资料

　　本组35例膀胱移行细胞癌石蜡标本来自武汉市第五医院2003年7月至2006年12月期间的部分手术切除标本。其中男21例, 年龄25～68 岁；女14例,年龄33～ 69岁。所有病理标本均经病理诊断为膀胱移行细胞癌。肿瘤病理分级根据世界卫生组织(WHO)分类标准, 临床分期根据国际抗癌联盟标准进行TNM分期。另取5 例前列腺增生症手术患者的膀胱组织作阴性对照。

　　1.2 免疫组织化学方法

　　采用S?P方法，一抗鼠抗人MMP?2、TIMP?2单克隆抗体、S?P 试剂盒及DAB 显色试剂盒均购自武汉博士德生物有限公司。切片常规脱腊，逐级脱水，3.00% H2O2消除内源性过氧化物酶，抗原修复，依次加入一抗、二抗，DAB 染色，苏木素复染，透明封片。用试剂盒所带的阳性切片作阳性对照, 代替一抗作阴性对照。镜下观察肿瘤组织中出现棕黄色颗粒为阳性细胞，高倍镜下随机选择5个高倍视野, 以阳性细胞百分率＞25.00%定为阳性，≤ 25.00%为阴性。

　　1.3 统计学处理

　　所有数据输入计算机，用统计软件11.5 处理。采用Fisher精确检验法，以P<0.05 为有显著性差异。

　　2 结果

　　2.1 膀胱癌的病理分级及临床分期

　　35例膀胱移行细胞癌中病理分级：G1占13例，G2占13例，G3占9例。临床分期：表浅性肿瘤共21例(其中Tis 占8例，T1占13例), 浸润性肿瘤共14例(其中T2占5例，T3占6例，T4占3例)。

　　2.2 MMP?2和TIMP?2的表达

　　5 例正常膀胱组织中MMP?2和TIMP?2的表达均呈阴性。16例膀胱移行细胞癌组织中肿瘤细胞有不同程度的MMP?2表达,主要位于肿瘤细胞的胞浆,呈棕黄色。18例膀胱移行细胞癌组织中肿瘤细胞和间质细胞有不同程度的TIMP?2表达。膀胱移行细胞癌中MMP?2 和TIMP?2的表达情况与肿瘤病理分级和临床分期的关系见表1。

　　2.3 MMP?2和TIMP?2与膀胱癌分化程度的关系

　　随肿瘤病理分级的增高,MMP?2在膀胱癌组织中的表达显著增强(P＜0.05),说明分化差的膀胱癌MMP?2的表达均明显高于分化好的膀胱癌。TIMP?2也在肿瘤各级表达，但各级表达与分级的高低无显著性差异（P＞0.05）。

　　2.4 MMP?2和TIMP?2与膀胱癌浸润深度的关系
　
　　随肿瘤分期的增高,MMP?2在膀胱癌组织中的表达显著增强(P＜0.05) , 说明浸润性膀胱癌MMP?2的表达明显高于浅表性肿瘤; 而TIMP?2在低期和高期肿瘤之间的表达无显著性差异（P＞0.05）。

　　表1 MMP?2、TIMP?2在肿瘤中的表达与肿瘤临床分期、病理分级的关系（略）

　　注：* 组间比较。其中MMP?2临床分期及病理分级组间比较，P<0.05；TIMP?2临床分期及病理分级组间比较，P＞0.05。

　　3 讨论

　　膀胱移行细胞癌(Traitional cell carcinoma of bladder, TCCB) 是泌尿系统最常见的肿瘤, 20% 的患者初发时具有侵袭性, 即使经过治疗, 也较早转移；而80%为浅表性肿瘤,但其中70%手术后复发,复发者的30%向高级高期发展［1］。研究与TCCB浸润、转移等相关因素对选择适宜的治疗方法及判断预后具有重要的临床意义。

　　浸润和转移是恶性肿瘤最基本的生物学特性, 也是肿瘤病人死亡的直接原因。近年来,通过对肿瘤转移机制的广泛研究，发现细胞外基质(extracellular matrix, ECM)在肿瘤的浸润与转移过程中起着关键性作用。在肿瘤细胞的浸润和转移过程中，肿瘤细胞必须具有降解基底膜和细胞间基质组成的细胞外基质的能力。因此，参与此过程的一些细胞因子引起学者们广泛的研究。已有大量研究表明, 肿瘤细胞产生的基质金属蛋白酶(MM) 在其侵袭转移过程中起了相当重要的作用, 因为肿瘤细胞突破ECM的阻碍主要依赖于MM对ECM 的降解［2］。

　　MM最早发现于1962年，是一类结构上极具同源性、编码基因与胶原酶同源的蛋白分解酶家族［3］。MM 是一组锌离子依赖性内肽酶，MMP?2是IV型胶原酶的一个亚型，其降解底物主要为IV型胶原, 而IV型胶原是基底膜及细胞间基质的主要成分, 也是肿瘤细胞脱落和游走的主要障碍。有研究表明，MMP?2还能够促进新生血管的形成, 提示MMP?2 在肿瘤的生长过程中起重要作用［4］。

　　生理情况下，MM的活性在多个水平受机体调控，包括转录、分泌、激活以及TIMP的抑制作用。TIMP?2是细胞产生的MMP?2抑制因子，它能特异性地与MMP?2以非共价键形式结合，终止MMP?2的活性。在体外实验中，TIMP?2的基因转染可以有效地降低肿瘤细胞株的生长与转移能力［5］。在肿瘤组织内，TIMP?2的表达一般都高于正常组织［6］，这是机体针对肿瘤组织内MMP?2升高而产生的继发性基因表达上调，本组实验中膀胱癌细胞与间质中也较正常粘膜有高水平的TIMP?2表达，证明肿瘤内部确有调节TIMP?2升高的机制存在［7］。

　　本研究显示，MMP?2在免疫组化中, 由肿瘤细胞表达为主, 说明肿瘤细胞本身分泌MMP?2 较多，且随着肿瘤的分级增高其表达显著增强。提示MMP?2和与膀胱癌的恶性行为有关，与TCCB 的侵袭转移有着密切的联系,由此我们进一步推断MM P?2的表达水平可以用于膀胱癌的诊断。有研究表明［8，9］，MMP?2在TCCB中的表达强度随浸润深度而增加，并与TCCB的分级高低呈正相关，提示在TCCB 的进展和分化过程中，肿瘤分化程度越低, 肿瘤细胞分泌MMP?2越多, 其浸润和转移的能力也越强。本组研究也证实了这一点:MMP?2的表达随肿瘤分级增高而增强的同时, 随肿瘤分期的增高也相应增强, 说明MMP?2在膀胱肿瘤基底膜降解、肿瘤侵袭和转移过程中可能起到更为重要的作用。我们认为，MMP?2与膀胱癌的分级分期均存在正相关, 即MMP?2与TCCB的侵袭和转移密切相关, MMP?2可能作为判断TCCB进展及TCCB患者预后的有效标志物。

　　另有研究认为, 进展期膀胱癌由于其本身的侵袭性, 导致了血清MM的增加, 而同时膀胱癌在生长和转移时破坏了膀胱壁的基质，MM由肿瘤细胞直接或脱落细胞溶解后释放入尿液, 从而使从体液中检测MM作为一种无创性的诊断膀胱癌及判定预后的方法成为可能［10］。

　　本研究显示肿瘤细胞和间质细胞有不同程度的TIMP?2表达，并且与肿瘤的病理分级和临床分期无相关性，这可能与TIMP?2的作用机制有关，TIMP?2总是以1：1的比例与MMP?2结合阻断其活性，如果组织中存在过量的TIMP?2，它则能激活另一种金属蛋白酶&mdashmdash;膜型基质金属蛋白酶（MT?MMP）［11］。因此目前认为，TIMP?2在肿瘤组织中有着双向的调节功能，膀胱癌早期，细胞TIMP?2的表达机制健全，分泌过量的TIMP?2反而起到了促进肿瘤生长的作用。因此在肿瘤的不同时期都有表达，证明TIMP?2也与MMP?2一样能做为判断膀胱癌进展的标志物，但其表达水平的高低不能有效地判断肿瘤的临床分期和病理分级，其机理有待进一步探讨。

【参考文献】
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　　10 Moses MA, Wiederschain D, Loughlin KR, et al. Increased incidence of matrix metalloproteinases in urine of cancer patients. Curr Surg，2004，61(3):255～259 .

　　11 Imai K, Ohuchi E, Aoki T, et al. Membrane?type matrix metalloproteinase 1 is a gelatinolytic enzyme and is secreted in a complex with tiue inhibitor of metalloproteinases 2. Cancer Res，1996，56(12):2707～2710.