膀胱癌病人尿液中的特征物质研究

【摘要】 采用顶空气相色谱/质谱联用法分析膀胱癌病人的尿液，寻找尿液中的挥发性特征物质，以期作为尿液检查诊断膀胱癌的一种方式。选取一组膀胱癌患者，对其尿液进行定性定量分析，并将分析结果与健康人尿液进行比较。进样口温度280℃，进样量100 μL；起始柱温45℃，保留3 min，以16℃/min的速率程序升温到280℃。结果表明：膀胱癌病人尿液中含有两种特征物质4?庚酮和二甲基硫醚。膀胱癌患者尿液中4?庚酮的浓度范围为0.14～1.32 μL/L；二甲基硫醚的浓度范围为0.009～0.73 μL/L。推测4?庚酮可能来源于增塑剂邻苯二甲酸二异辛酯（di(2?ethylhexyl) phthalate, DEHP）在人体内的降解；二甲基硫醚来源于含硫化合物在人体内的合成与降解。尿液中4?庚酮和二甲基硫醚的含量与膀胱癌具有相关性。

【关键词】 膀胱癌，尿液，特征物质，顶空气相色谱/质谱联用

　　Study on the Characteristic Components　in the Human Urine with Bladder Cancer

　　Zhu Feng?Ｙing, Yu Ai?Ｎa, Qiu Yi?Ｈong, Sa Ying?Ｌong, Wang Fu?

　　1(Department of Energy, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237)

　　2(Department of Biomedicine Engineering, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240)

　　3(Department of Urology, Sixth People‘s Hoital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200233)

　　Atract　A group of human urines with bladder cancer were qualitatively and quantitatively analyzed under the condition of 280℃ injection temperature, 45℃ initial column temperature, 3 minutes column temperature retaining and 280℃ terminate temperature at the rate of 16℃/min. The analytical results were compared with those of the urine of controls. The characteristic components in the human urine with bladder cancer were 4?heptanone and dimethyl sulfide. The concentratio of 4?heptanone and dimethyl sulfide were ranged from 0.14 μL/L to 1.32 μL/L and from 0.009 μL/L to 0.73 μL/L reectively. The results indicate that the 4?heptanone could be caused by the degradation of plasticizer di(2?ethylhexyl) phthalate（DEHP）in the human body and dimethyl sulfur is caused by the synthesis and degradation of the compounds containing sulfide. The concentration of 4?heptanone and dimethyl sulfide in the urine has a relatiohip with bladder cancer.

　　Keywords　Bladder cancer, human urine, characteristic components, headace gas chromatography?ma ectrometry

　　1　引　言

膀胱癌是泌尿系统恶性肿瘤中最常见的一种，占恶性肿瘤的3%。诊断膀胱癌一般进行尿液检查和膀胱镜检查，尿液检查不是膀胱癌很可靠的检查手段，膀胱镜检查，用膀胱镜检查膀胱内壁，通常需要全身麻醉，检查后患者会感到尿道疼痛和不适[1] 。这些现有的常规诊断手段会给病人带来疼痛，并且操作复杂，成本较高。为此，许多科学工作者正在研究更简单、方便及无痛的诊断方式。有报道在英国小狗通过训练能嗅闻出膀胱癌病人的尿液，研究人员认为，这是由于癌症病人的尿液中存在某些特殊的化学物质。如果狗能嗅别这些物质，采用这种测试的相关仪器，例如质谱分析仪，也有可能作出这样的鉴定 [2]。现有的膀胱癌肿瘤标志物有如下几种：蛋白质组学、核基质蛋白22（NMP22）、增殖细胞核抗原(PCNA)、E?钙粘蛋白(E?CD)、转化生长因子(TGF?eta;)、端粒酶(TLMA)、环氧化酶(COX)及基质金属蛋白酶类(MM)等[3]。这些标志物都是从生物、医学角度进行研究的，而本研究采用顶空GC?MS法分析膀胱癌病人的尿液，试图找出一种或者几种挥发性的特征物质，作为尿液检查诊断膀胱癌的一种方式。

　　2　实验部分

　　2.1　仪器与试剂

6890/5973N气相色谱/质联用仪和7694E顶空进样器（Agilent 公司）。
15份膀胱癌病人尿液（上海市第六人民医院泌尿科），10份健康人体尿液（无相关病史的健康人群）。4?庚酮，纯度98%；二甲基硫醚，纯度≥99%（德国Sigma?Aldrich公司）。

　　２．２　样品的采集

所有尿液均用300mL塑料瓶采集，病房内当场采样，立即用塑封带密封，贴上标签，然后放置于盛有冰块的保温桶中运回，保存于4℃的冰箱冷藏室中，样品保存时间不超过2个月。

　　2.3　标准溶液的配制

尿液中含有大量水，而4?庚酮和二甲基硫醚皆不溶于水。为了保证4?庚酮、二甲基硫醚标样与尿液中的4?庚酮、二甲基硫醚所处环境一致，实验采用10 μL微量进样器抽取1 μL 4?庚酮、二甲基硫醚标准品分别溶于8 mL甲醇。完全溶解后再分别转移至100 mL的容量瓶中，然后加去离子水稀释至刻度线，配成10 μL/L（Ｖ／Ｖ）标准溶液。将10 μL/L标准溶液作为起始溶液，分别稀释配成4.0、2.0、1.0、0.5、0.25和0.05 μL/L ６种不同浓度的4?庚酮标准溶液以及2.5、1.0、0.1、0.01及0.002 μL/L ５种不同浓度的二甲基硫醚标准溶液。

　　2.4　色谱/质谱条件

HP?5ms色谱柱（30 m&time0.25 mm&time0.25 μm）；载气：高纯氦气(99.9995%)；载气流量：1.0 mL/mi 分流比：1∶1；进样口温度：280℃；柱温：起始温度45℃，保留3 min，以16℃/min的程序升温到280℃；进样量：100 μL。电子轰击源(EI)；电离能量：70 eＶ；质量扫描范围(m/z)：33～800；离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；标准谱库：NIST 5.0。

顶空进样样品管温度：100℃；传输线温度：110℃； 样品瓶温度：80℃；GC循环时间：15　min；加压时间：2.0　min；样品瓶平衡时间：2.0　min；样品管充填时间：0.5　min； 样品管平衡时间：0.05　min；进样时间：1.0 min。

取10　mL尿液于样品瓶中，盖上橡胶塞和铝盖，用封盖器封盖。将配置好的尿液置于顶空进样器中，进行GC?MS分析。

　　3　结果与讨论

　　3.1　膀胱癌病人尿液的分析

选取了15位膀胱癌病人，他们都未进行过化学治疗，其中8位未做过手术，7位是做过手术切除肿瘤的病人。图1为膀胱癌病人尿液的顶空GC?MS总离子流图，共检出4个组分，图中4.79 min处的组分为色谱柱固定液流失所致。经NIST谱库检索，各组分的定性结果见表1。表1　膀胱癌病人尿液中的特征有机成分（略）　

　　由于每个人的生活环境、饮食习惯的不同，所以其尿液代谢组分存在较大的个体差异。15个膀胱癌病人尿液的顶空GC?MS总离子流图都是在相同的实验条件和实验方法下获得，从定性分析结果来看，膀胱癌病人尿液的检测结果表现如下：（1）采用顶空GC?MS的方法，实验中样品保持80　℃加热20 min，所以一些非挥发性物质是检测不到的。4?庚酮是出现概率最高的一种化合物，其中14位病人的尿液中都含有这种化合物。一部分病人尿液中含有硫化合物，主要为二甲基硫醚;（2）因个体环境差异导致一些特别的化合物出现，但只是个例，没有规律性，这是由于病人个人生活环境和饮食习惯所导致。实验表明,在14位病人的尿液中检测到了4?庚酮，占总样本的93％;6位患者的尿液中含有二甲基硫醚，占总样本的40％; 其中既有4－庚酮又有二甲基硫醚的患者为5位，占总样本的３３％。

　　3.2　健康人尿液的分析

选取10位未患过膀胱类泌尿系统疾病，也无其它癌症史，年龄介于20至60岁之间的健康人。在10位健康人尿液GC?MS总离子流图中，除了一个较大的空气峰外，没有其它峰出现。换言之，在健康人尿液中没有检测到与膀胱癌病人尿液中发现的相同物质。

将膀胱癌病人尿液和健康人尿液分析结果作对比，可以得出以下结论：膀胱癌病人尿液中含有不同于健康人体的4?庚酮、二甲基硫醚和二硫化碳３种挥发性有机物；4?庚酮出现的概率高达93％，可以肯定4?庚酮是膀胱癌病人尿液中的特征物质。二甲基硫醚出现的概率为40％，因此二甲基硫醚有可能是膀胱癌病人尿液中的特征物质。

　　３.3　4?庚酮和二甲基硫醚的产生机理

据文献［４］报道，邻苯二甲酸二（2?乙基）己酯(DEHP) 作为一种增塑剂在环境中大量存在，对人和动物的多种器官产生毒副作用，包括肝脏、生殖道、肾脏、肺、膀胱和心脏。ＤＥＨＰ可通过食物被摄入人体，其中水和空气是主要途径。DEHP进入人体后在体内快速水解脱去一份酯，生成2?乙基己醇。2?乙基己醇被氧化生成2?乙基己酸，而2?乙基己酸再经氧化最终生成4?庚酮。

4?庚酮是DEHP在人体内的最终代谢产物，本实验推测尿液中检测到的4?庚酮可能来源于此。而国际肿瘤研究中心（IARC）将DEHP划分为第３类致癌物，即动物可疑致癌物，而非人类致癌物。因为目前只有动物实验的结果表明，DEHP可能具有致癌性，迄今尚无人体流行病学资料。DEHP可促进肝癌和肾肿瘤的发展，但未发现它具有单独诱导肿瘤发生的作用。

Wahl等［４］采用顶空GC?MS法将做过血液透析和没有做过血液透析的人体血液做比较，由于血液透析牵涉到一次性医疗用具，它们含有大量DEHP。结果发现，做过血液透析的人体血液中的4?庚酮含量达到0.118 mg/L，而没有做过血液透析的人体血液中4?庚酮含量只有0.0128 mg/L。

二甲基硫醚（DMS）是海洋表层浮游植物排放到大气中的主要挥发性含硫化合物，其向大气的排放量约占全球海洋硫排放量的三分之二。二甲基硫醚主要来自海藻中的二甲基磺酸丙酯(DM)的降解。DM降解主要有两种方式：一是细菌的DM裂解酶分解DM产生二甲基硫醚；二是不产生二甲基硫醚，而经由二甲基硫前体变成3?甲基硫酸酯，随后形成CH3SH而降解。DM的第一种降解方式产生二甲基硫醚和丙烯酸，其反应方程式如下[5]：
Ｓ＋ＣＨ３ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯ－ＳＣＨ３ＣＨ３＋ＣＨ２ＣＨＣＯＯＨ

海洋中二甲基硫醚的产生过程对研究人体内的二甲基硫醚的来源有一定的启发[6]。人体内含有各种各样的生物活化酶，也具备合成DM的各种条件。当含硫化合物通过各种方式侵入人体后完全有可能在人体内转化成DM。而DM在人体内遭到病毒侵染和细胞衰老等过程，促使DM从体内代谢释放出来，生成二甲基硫醚。

　　3.4　4?庚酮和二甲基硫醚的定量分析

用4?庚酮标样和二甲基硫醚标样分别制作标准曲线。为保证实验结果的重现性，尽量减少偏差，将各种浓度的标准溶液分别测试３次，实验条件和进样量与前尿液测试完全一致。实验采用阶梯式进样，从最低浓度标准溶液开始进样，以免高浓度标样的残留影响低浓度标样。采用选择离子方式进行面积积分，选取m/z 71作为4?庚酮的特征离子（见图２a）。

　　将图2a中的m/z 71峰进行积分，得到4?庚酮标样的峰面积，取各浓度下３次测试的平均值为平均峰面积。以平均峰面积为纵坐标，对应的浓度为横坐标，绘制4?庚酮标准曲线。结果表明，标准曲线的回归方程为：y=353843x－19164，相关系数r=0.9948，线性范围为0.05～4 μL/L。

　　将图3a的m/z 62峰进行积分，得到二甲基硫醚标样的峰面积。取各浓度下３次测试的平均值为平均峰面积。以平均峰面积为纵坐标，对应的浓度为横坐标，绘制二甲基硫醚标准曲线，结果表明，标准曲线的回归方程为：y=548891x，相关系数r=0.9969，线性范围为0.002～2.5 μL/L。

同样采用质谱选择离子方式，以m/z 71为特征离子，将15位膀胱癌病人尿液总离子流图中4?庚酮峰进行面积积分，分析结果见表2，并根据标准曲线的回归方程y=353843x－19164，计算得到相应的4?庚酮浓度。

15位膀胱癌病人中14位病人的尿液中含有4?庚酮，浓度范围为0.14～1.32 μL/L。

同样采用选择离子方式，以m/z 62为特征离子，对15位膀胱癌病人尿液中二甲基硫醚峰进行面积积分，积分数据见表２，并根据标准曲线的回归方程y＝548891x，计算得到相应的二甲基硫醚浓度。

15位膀胱癌病人中6位病人的尿液中含有二甲基硫醚，范围为0.009～0.73 μL/L。表2　膀胱癌病人尿液中4?庚酮和二甲基硫醚的浓度（略）

　　膀胱癌病人尿液中含有4?庚酮和二甲基硫醚这两种有别于健康人体的特征物质。人类在寻找癌症病因和发生条件过程中，发现80%以上的癌症均由环境因素引起的，而环境因素中的75%以上为化学因素。因此推测4?庚酮可能来源于增塑剂邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)在人体内的降解；二甲基硫醚来源于污染物二氧化硫及其衍生物在人体内的合成与降解，其生成机理有待于进一步研究。

【参考文献】
　　1　Barkman Ｒ, Xu Jun?Ｃai(许俊才)．What Ｓhould Ｗe Ｌearn Ａbout the Ｃancer(癌症我们应该了解什么)．Shanghai(上海)： Fudan University Pre(复旦大学出版社)， 2003： 53～55

　　2　Willis Ｃ Ｍ, Church Ｓ Ｍ, Guest Ｃ Ｍ, Ｃook W A, McCarthy N, Braury A J, Church M R T, Church J C T. British Medical Journal， 2004, 329(7468):712～714A

　　3　Hou Zhen?Ｊiang (侯振江)． Chinese Jounal of Celiopathy(中华腹部疾病杂志)， 2005， 5(12)： 930～932

　　4　Wahl H G, Hong Q F, Hilderand S, Risler T, Luft D, Liebich H． Nephrology Dialysis Tralantation， 2004， 19(10)： 2576～2583

　　5　Li He?Ｙang (李和阳)， Lin Yi?Ｍing(林益明)． Journal of Xiamen University(厦门大学学报)， 2001， 40(3)： 715～725

　　6　Sato H, Hirose T, Kimura T, Moriyama Y, Nakashima Y. Journal of Health Science．， 2001， 47(5)： 483～490