膀胱癌肿瘤　睾丸抗原相关基因的表达

【关键词】 膀胱肿瘤

　　Expreion of cancer/testis antigenrelated genes in human bladder cancer

　　YAN HongLiang, WANG He, LI Xin, LIU HeLiang

　　Department of Urology Surgery, Xijing Hoital, Fourth Military Medical University, Xia 710033, China

　　【Atract】 AIM: To investigate the genes expreion of cancer/testis antige (CTA) in human bladder cancer. METHODS: Reversetracription polymerase chain reaction (RTPCR) was used to investigate the expreion of the MAGEA1, X2, NYESO1, MAGEC1, MAGEE1 and HAGE genes in 33 bladder cancer samples and correonding nontumorous bladder tiues. Three samples randomly selected from each CTA PCR product were sequenced. RESULTS: In the 33 tumor samples, the MAGEA1, X2, NYESO1, MAGEC1, MAGEE1 and HAGE mRNA expreion rates were reectively 21.2% (7/33), 39.4% (13/33), 69.7% (23/33), 42.4% (14/33), 36.4% (12/33) and 24.2% (8/33). In tumor tiues, the positivity rate was found to be 75.8% (25/33) for at least one of these genes expreion, and 69.7% (23/33) for two and more than two. Almost none of the nontumorous bladder tiues were positive for these genes. The DNA sequence confirmed that the RTPCR products were CTA cDNA. CONCLUSION: The cancer/testis antige are potential targets for antigenecific immunotherapy of bladder cancer. The coexpreion pattern of these antige provides a theoretic foundation for the development of a polyvalent bladder cancer vaccine.

　　【Keywords】 bladder neoplasms；CTA; MAGEA1 X2；NYESO1；MAGEC1； MAGEE1； HAGE

　　【摘要】 目的：检测多种肿瘤/睾丸抗原相关基因在膀胱癌中的表达状况. 方法：用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法对33例膀胱癌患者癌组织和癌旁正常膀胱组织进行MAGEA1，X2，NYESO1，MAGEC1，MAGEE1和HAGE的mRNA表达检测. 随机抽取每种CTA基因的3例阳性RTPCR扩增产物的目的片段进行DNA序列测定. 结果：33例膀胱癌标本中MAGEA1，X2，NYESO1， MAGEC1，MAGEE1和HAGE的表达频率分别为21.2%(7/33)，39.4%(13/33)，69.7%(23/33)，42.4%(14/33)，36.4%(12/33)和24.2%(8/33). 正常膀胱组织中6种CTA基本无表达. 肿瘤组织中6种基因至少有1种表达的频率是75.8%(25/33),两种或两种以上同时表达几率是69.7%(23/33). 测序结果表明RTPCR产物确为CTA目的基因序列. 结论：CTA在膀胱癌主动免疫治疗中是一种合适的、有前景的攻击靶点. 同时,多种CTA的联合表达为多效价CTA疫苗在膀胱癌免疫治疗中的应用提供了理论基础.

　　【关键词】 膀胱肿瘤；肿瘤睾丸抗原；MAGEA1； X2； NYESO1； MAGEC1；MAGEE1；HAGE

　　0引言

　　肿瘤/睾丸抗原(cancertestis antigen, CTA)是一类肿瘤特异性抗原,只在肿瘤中表达,在正常组织(睾丸和胎盘除外)中均不表达,因而成为肿瘤疫苗研究中最有价值的一类抗原［1］. 目前有关这一类抗原在膀胱癌中的表达情况在国外报道较少,而在国内尚无报道. 我们应用RTPCR方法对33例不同临床分期的膀胱癌患者肿瘤组织中多种CTA的mRNA表达进行了检测,以期为CTA疫苗用于膀胱癌患者的免疫治疗提供理论依据及检验CTA的mRNA表达率与临床分期的关联性.

　　1材料和方法

　　1.1材料我院200206/200311的膀胱癌标本33（男25,女8）例,年龄36～78(平均65.2)岁. 术中取材,先取远离肿瘤的正常膀胱组织(距肿瘤边缘5 cm以上) ,取肿瘤组织. 组织块直径0.5 cm,即刻分装,放入液氮中保存. 瘤体及癌旁正常组织均有病理切片证实. 膀胱移行细胞癌28例,膀胱鳞癌3例,腺癌2例,淋巴结阳性24例,淋巴结阴性9例，Ⅰ期3例，Ⅱ期10例，Ⅲ期16例，Ⅳ期4例. 以正常睾丸组织作为阳性对照.

　　1.2方法取液氮中保存的标本约0.1 g,加TRIZOL 1 mL(Gibco公司)研磨. 4℃，3600 g，离心10 min. 中间清亮液室温孵育5 min. 加入三氯甲烷0.2 mL，剧烈摇动15 s，室温孵育3 min，4℃，3600 g，离心10 min. 分层后,吸取水样层，加入异丙醇0.5 mL，混匀，室温孵育10 min，4℃，3600 g，离心10 min. 弃上清，加入750 mL/L乙醇1 mL，洗涤RNA 1次，4℃，7500 r/min，离心5 min. 干燥RNA沉淀5 min,DEPC水溶解RNA，紫外分光光度计定量，-70℃冰箱保存RNA备用. cDNA的合成(反应体系20 μL)取组织RNA 5 μg,加入随机引物50 pmol(Takara公司),AMV逆转录酶166.7 nkat(TakaRa公司),dNTP混合物2 μL，RNasin 20 U(Takara公司),加DEPC水至终体积20 μL. 42℃孵育60 min,95℃灭活5 min. 冰水冷却2 min. 所得逆转录产物用于PCR扩增. CT基因的PCR扩增每个逆转录cDNA产物均在扩增出βactin后再进行目的基因扩增,以保证模板cDNA的质量. 取分别来自膀胱癌组织和癌旁正常膀胱组织的cDNA为模板进行PCR反应,对MAGEA1，X2，NYESO1， MAGEC1，MAGEE1和HAGE的基因进行检测. 引物设计参见文献［2］,引物合成由上海申友生物技术公司完成. 逆转录产物1.5 μL,引物各1 μL，5 MU/L Taq DNA聚合酶0.5 μL,10 mmoL/L dNTP混合物2.5 μL,10×PCR反应缓冲液3 μL，加入H2O2至终体积为30 μL. 反应条件:MAGEA1: 93℃ 1 min, 60℃ 1 min, 72℃ 3 min；X2: 94℃ 1 min, 57℃ 45 s，72℃ 1 mi NYESO1: 94℃ min, 60℃ 45 s, 72℃ 1 mi MAGEC1: 94℃ 1 min, 60℃ 45 s，72℃ 4 miMAGEE1 94℃ 1 min, 55℃ 45 s, 72℃ 1 mi HAGE: 94℃，1 min, 57℃ 45 s, 72℃ 1 miβactin: 94℃ 45 s, 55℃ 45 s, 72℃ 45 s. 所有反应均经预变性,94℃ 5 min,扩增35个循环后,72℃延伸5 min. 反应结束后,取PCR反应产物5 μL,经10 g/L的琼脂凝胶电泳,溴化乙锭染色鉴定. 随机抽取上述6种CTA的阳性PCR产物(各3例)进行纯化和序列测定. PCR产物纯化采用上海华舜生物工程公司胶回收试剂盒,操作按说明书进行. DNA序列测定由上海基康生物技术公司完成.

　　统计学处理: 计数资料行χ2检验，P<0.05为有统计学意义，全部数据用 11.5统计软件完成.

　　2结果

　　所有标本均经紫外分光光度仪检测所提取总RNA的浓度及纯度, A260 nm/A280 nm>1.8. 经变性甲醛/琼脂糖凝胶电泳分析,所提取总RNA在约为4.5 kb和1.9 kb处分别有两条亮带(28SRNA和18SRNA),且28S的荧光强度约为18S的2倍,表明RNA未发生降解,其相对分子质量分布正常.

　　2.1CTA基因在膀胱癌中的表达膀胱癌标本33例中MAGEA1，X2，NYESO1， MAGEC1，MAGEE1和HAGE的表达频率分别为21.2%，39.4%，69.7%，42.4%，36.4%和24.2%(Tab 1, Fig 1). 正常膀胱组织6种CTA基因基本无表达. 肿瘤组织中至少有1种基因表达的频率是75.8%(25/33),
　　两种或两种以上同时表达的频率是69.7%(23/33) . 测序结果表明6种CTA基因的RTPCR产物与GeneBank检索的序列一致.

　　表1RTPCR引物序列及扩增片段大小　略

　　图1MAGEA1，X2，NYESO1， MAGEC1，MAGEE1 ， HAGE 以及βacti mRNA表达的RTPCR检测结果　略

　　2.2在膀胱癌中CTA基因的表达与分期分级的关系我们还研究了CTA基因在膀胱癌中表达率最高的NYESO1在膀胱肿瘤Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ期中的表达分别为1/3，6/10，13/16和3/4，经统计学分析,CTA基因表达与患者临床分期无关(P>0.05).

　　3讨论

　　关于CT抗原在睾丸中的选择性表达和在肿瘤中的异常表达确切机制还不明确. 肿瘤的免疫治疗已有上百年的历史, 但因特异性差, 效果不理想. 随着肿瘤特异性抗原MAGEA1发现以来,肿瘤特异性免疫治疗更具有针对性,已进入一个崭新阶段. 我们发现MAGEA1，X2，NYESO1， MAGEC1，MAGEE1和HAGE的表达率分别为21.2%，39.4%，69.7%，42.4%，36.4%和24.2%. 本组实验NYESO1和MAGEC1在肿瘤旁有两例和1例检测出，考虑可能由于手术种植或肿瘤的微转移，本组实验还对膀胱肿瘤中表达率最高的NYESO1的表达和临床的分期的关系进行了观察，临床分期根据膀胱肿瘤的TNM分期（WHO 1998）标准和临床病理结果，发现NYESO1在膀胱肿瘤Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ期中的表达分别为1/3，6/10，13/16和3/4，经统计学分析NYESO1的表达率与分期无显著学差异（P>0.05），但本实验病例较少，期间是否存在关联有待进一步研究. 其中6种基因至少有1种的表达率是75.8%(25/33),而两种或两种以上联合表达率是69.7%(23/35). 本实验与Scanlan等［2］报道的膀胱肿瘤中MAGEA1，X2，NYESO1， MAGEC1，MAGEE1和HAGE的表达率（22%，44%，80%，44%，44%,24%）基本相符. MAGE基因是应用肿瘤特异性（CTL） 法从黑色素瘤中发现并分离出的第一个人类肿瘤特异性抗原基因. 人工合成的MAGE1, 3基因编码的抗原肽已作为疫苗用于黑色素瘤、肝癌等恶性肿瘤的Ⅰ,Ⅱ期临床治疗,并取得较好疗效［3,4］. X基因是近年来应用SEREX 法从黑色素瘤中新发现的一组CTA 基因［5］,迄今已发现5个家族成员,分别命名为X1, X2, X3, X4和X5. NYESO1是Chen等应用SEREX法从食管癌中分离出的一种CTA，研究显示,NYESO1是Mr 22×103的疏水蛋白,功能尚不清楚,其编码基因位于染色体Xq28. 目前认为NYESO1是现知的免疫原性最强的一种肿瘤抗原,在40%～50%的NYESO1阳性肿瘤患者体内可检测出NYESO1抗体和针对NYESO1的CD8+ T淋巴细胞反应［6］. 近年来,国内外学者发现应用MAGE1, MAGE3和NYESO1抗原肽［7］可以诱导出MHCⅠ，Ⅱ类限制性T 淋巴细胞反应,它们在健康人和肿瘤患者中均成功诱导出特异性细胞毒性T 细(CTL)［7,8］. 这说明应用多种CT抗原肽对肿瘤病人进行免疫治疗可以诱发机体的主动免疫反应, 具有很好的应用前景. 制备以NYESO1为主联合多种CTA制备的多价肿瘤疫苗将可用膀胱癌患者的免疫治疗,也许还可以用于这类患者的辅助诊断和作为监测复发、转移和预后的指标.

　　【参考文献】

　　［1］ ELke J, Dirk J, Knuth Alexander. Clinical cancer vaccine trials［J］. Curr Opin Immunol, 2002;14(2): 178-182.

　　［2］ Scanlan MJ, Simon AJ, Old LJ. The cancer/testis genes: Review, standardization, and commentary［J］. Cancer Immunity, 2002；4(1):1-15.

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　　［4］ 李林， 欧阳为明，陈丽华， 等. 人黑色素瘤抗原MAGEA10的基因克隆及原核表达［J］. 第四军医大学学报，2004；25（9）：805-807.
Li L, Ouyang WM, Chen LH, et al. Gene cloning and prokatyotic expreing of huma melanoma antigen MAGEA10［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2004；25（9）：805-807.

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　　［8］ 王彦刚, 章翔, 费舟,等. 基于RTPCR基础上的体内重组法构建人源性胶质瘤单链抗体库［J］. 第四军医大学学报，2004；23（23）：2175-2178.

　　Wang YG, Zhang X, Fei Z, et al. Cotruction of phage library of human glioma single chain fragment variable region antibody by in vivo recombinaton based on RTPCR［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2004；23（23）：2175-2178.

　　第四军医大学西京医院泌尿外科，陕西 西安 710033

　　基金项目：陕西省科技攻关计划项目 （200210G4）

　　通讯作者：李欣. Tel.(029)83375762 Email.lixin@fmmu.edu.cn

　　作者简介：闫宏亮（1974），男（汉族），吉林省吉林市人. 讲师，硕士生（导师王禾）. Tel.(029)83375321Email.yhl740315@163.com

　　编辑袁天峰