膀胱癌细胞凋亡与MDM2和P53基因表达的意义

【关键词】 膀胱肿瘤；P53基因；MDM2基因；免疫组织化学；细胞凋亡

［摘 要］ 目的：研究膀胱癌细胞凋亡、MDM2、P53基因表达的意义。方法：采用免疫组织化学方法及TUNEL法检测11例“正常膀胱黏膜”和83例膀胱移行细胞癌中MDM2、P53基因的表达及细胞凋亡指数。结果：P53阳性率为50.6%,MDM2阳性率为59.03%，AI=1.433 5±0.386 3。MDM2阳性表达与病理分级及临床分期呈负相关(R=-0.263,P=0.016及R=-0.388,P=0.001)53阳性表达与病理分级及临床分期呈正相关(R=0.492,P=0.001；R=0.341，P＜0.01);MDM2、P53三种蛋白间表达无相关性；AI与MDM2呈负相关（R=-0.226,P=0.042）；AI与病理分级及临床分期呈正相关(R=0.642,P=0.000；R=0.455，P=0.000)；AI与P53无相关性。AI、P53、MDM2的表达与5 a生存率有关。结论：联合运用临床分期及病理分级并检测P53、MDM2可用于判断膀胱移行细胞癌的预后。

　　［关键词］ 膀胱肿瘤；P53基因；MDM2基因；免疫组织化学；细胞凋亡

　　Clinical Significance of Expreion of MDM2 P53 Protein and Apoptosis in Bladdercancer

　　YANG Chenggang，ZHANG Lijuan，LI Mei，et al

　　(Tumor Hoital of yuan Province,Kunming, Yuan 650118,China)

　　Atract：Objective To investigate the expreion of MDM2 Pgp protein and apoptosis and its significance in bladder cancers.Methods Apoptosis Index(AI) was aeed with TUNEL technique,and immunohistochemical stainings of MDM2 and Pgp were performed in 83 cases of the carcinomas and 11 “normal” bladder mncosa.Results The positive expreion rate of P53 gene was 50.6% and MDM2 was 59.03%,and AI=1.433 5±0.386 3.The level of MDM2 was negative correlated with the tumor pathological grade and clinical stage(R=-0.263,P=0.016及R=-0.388,P=0.001);The level of P53 was positive correlated with the tumor pathological grade(R=0.492,P=0.001)o correlated was found between MDM2 and P53 gene;The level of AI was negative correlated with MDM2(R=-0.226,P=0.042);The level of AI was positive correlated with the tumor pathological grade and clinical stage (R=0.642,P=0.000；R=0.455，P=0.000);The level of AI was no correlated with P53.AI and the expreion of P53 and MDM2 were related to 5year survival rate.Conclusion By exerting the tumor pathological grade and clinical stage and detecting P53 MDM2 genes expreio,the prognosis of bladder cancer can be decided.

　　Key words：Bladder neoplasm；P53 gene；MDM2 gene；Immunohistochemistry；Apoptosis

MDM2基因是一原癌基因，与P53构成降解反式激活循环通路，参与细胞生长抑制、凋亡、细胞周期调控等过程。细胞凋亡是由基因调控的细胞主动死亡过程，同肿瘤的发生发展以及临床治疗有密切的关系。本研究采用免疫组化方法观测MDM2、P53基因在人膀胱癌细胞中的表达及用TUNEL法检测细胞凋亡，探讨它们在膀胱癌的发生发展中的作用及其对膀胱癌生物学行为和预后的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 收集本院病理科1996年至2004年间膀胱移行细胞癌83例及11例正常膀胱黏膜组织，83例膀胱移行细胞癌中男性66例，女性17例，年龄35岁~82岁，平均年龄58.5岁。病理检查前均未接受过放疗和化疗，术后均进行化疗药物膀胱灌注。按1999年WHO病理组织学分级标准，Ⅰ级29例，Ⅱ级31例，Ⅲ级23例；按UICC临床分期，TisT1期61例，T2T4期22例。所有标本均经10%甲醛固定、石蜡包埋，4 μm厚连续切片。术后随访16个月~5 a，平均38个月，失访5例，肿瘤复发或转移56例，死亡2例，无复发或转移20例。

　　1.2 方法

　　1.2.1 阴性、阳性检测 MDM2、P53单抗均购自福州迈新公司。采用SP法进性免疫组化染色，严格按照试剂盒说明书操作。用已知阳性切片作阳性对照，用代替一抗作阴性对照。结果判定：MDM2、P53以细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性细胞，阳性细胞＞10%为阳性结果，反之为阴性结果（见图1，图2）。

　　图1 P53阳性表达于肿瘤细胞核，呈棕黄色颗粒(×400)（略）

　　图2 MDM2阳性表达于细胞核呈棕黄色颗粒（×400）（略）

　　1.2.2 凋亡个数检测 细胞凋亡检测（末端脱氧核苷酸转移酶介导的xdUTP切口末端标记，terminal deoxynucleotide traferase mediated dUTPnick end labeling method,TUNEI法）试剂盒，DAB显色试剂盒购于福州迈新公司。步骤：切片脱蜡水化，3%H2O2清除内源性过氧化酶10 min，蒸馏水洗涤2 min共洗3次；加T1∶100蛋白酶K，37 ℃消化10 min，蒸馏水洗涤2 min共洗3次；每片加TDT和DIGdUTP各1 μl，标记缓冲液18 μl，4 ℃冰箱过夜，T洗2 min共洗3次；加封闭液50 μl，室温30 min；封闭液1∶100生物素化地高辛抗体50 μl，37 ℃反应30 min；T洗2 min共洗3次；加T1∶100稀释SABC，37 ℃反应30 min；T洗5 min共洗4次；DAB显色，苏木素衬染，脱水、透明、封片。实验中以不含TDT的试剂作阴性对照。结果判定：TUNEL法检测阳性表现为在肿瘤组织中散在分布胞核呈棕黄色颗粒着色的细胞(见图3)。在400倍光镜下，随机选择10个视野并计数1 000个肿瘤细胞，记录凋亡细胞数。计算细胞凋亡指数（AI），AI=（凋亡细胞数/1 000）×100%［1］。

　　图3 细胞凋亡阳性表现为肿瘤细胞核呈棕黄色颗粒（×400）（略）

　　1.3 统计方法 实验数据经统计软件包处理，数据以±s表示，采用t检验，方差分析，相关分析，cox多因数分析，以P＜0.05作为差异有显著意义的检验标准。

　　2 结果

　　2.1 检查 83例膀胱移行细胞癌中,有42例(50.6%) P53阳性,49例(59.03%) MDM2阳性，AI=1.433 5±0.386 3。

　　2.2 病理分级及临床分期中比较 MDM2Ⅰ级、Ⅱ级与Ⅲ级间表达差异有显著性(P＜0.05)，Ⅰ级与Ⅱ级间表达差异无显著性(P＞0.05)；P53Ⅰ级与Ⅱ、Ⅲ级间表达差异有显著性(P＜0.05)，Ⅱ级、Ⅲ级间表达差异无显著性(P＞0.05)。MDM2在TaT1与T2T4间表达差异有显著性(P＜0.05）,P53在两组中表达差异无显著性(P＞0.05)。AI在Ⅰ级、Ⅱ级与Ⅲ级间表达及TaT1与T2T4间表达差异有显著性(P＜0.01)。相关分析发现,MDM2阳性表达与病理分级及临床分期呈负相关(R=-0.263,P=0.016；R=-0.388,P=0.001)53阳性表达与病理分级及临床分期呈正相关(R=0.492,P=0.001；R=0.341，P=0.002);MDM2、P53两种蛋白间表达无相关性；AI与MDM2呈负相关（R=-0.226,P=0.042）；AI与病理分级及临床分期呈正相关(R=0.642,P=0.000；R=0.455，P=0.000)；AI与P53无相关性。5 a随访AI及P53复发死亡组显著高于无复发组；MDM2复发死亡组显著低于无复发组。详见表1。

　　2.3 MDM2基因在P53基因阳性表达在膀胱癌中的表达 分析发现P53阳性表达合并MDM2阳性表达多见于分化好的膀胱癌Ⅰ级、Ⅱ级与Ⅲ级间表达差异有显著性(P＜0.05详见表2。

　　表1 Pgp、MDM2、P53表达与病理分级及临床分期的关系（略）

　　注：*P＜0.05**P＜0.01

　　表2 MDM2基因在P53基因阳性表达膀胱癌中的表达（略）

　　注：*P＜0.05

　　2．4 P53、MDM2阳性表达与细胞凋亡的关系 P53阳性表达时AI显著高于P53阴性表达时；MDM2阴性表达时AI显著高于MDM2阳性表达时，见表3。

　　表3 P53、MDM2阳性表达与AI的关系（略）

　　注：*P＜0.05

　　2．5 P53、MDM2及细胞凋亡在膀胱癌中的预后价值 P53阳性表达的膀胱移行细胞癌中位生存期比P53阴性表达的膀胱移行细胞癌的低且差异有显著性（P＜0.05）；MDM2阳性表达的膀胱移行细胞癌中位生存期比MDM2阴性表达的膀胱移行细胞癌的高，差异有显著性（P＜0.01）；AI＜2.0的中位生存期比AI≥2.0组生存期长，差异有显著性（P＜0.01）。见表4。

　　表4 P53、MDM2及细胞凋亡在膀胱癌中的预后价值（略）

　　2．6 COX多因素回归分析 P53对生存率及复发死亡率的影响有统计学意义（P=0.007＜0.01，P=0.001＜0.01），即P53阳性表达者生存率低于阴性表达者,复发死亡率高于阴性表达者；MDM2阳性表达对生存率及复发死亡率的影响有统计学意义（P=0.003＜0.01，P=0.001＜0.01），即MDM2阳性表达者生存率高于阴性表达者,复发死亡率低于阴性表达者；临床分期及病理分级对生存率的影响有统计学意义（P=0.033＜0.05，P=0.002＜0.01），即随着临床分期及病理分级的增高生存率降低；病理分级对复发死亡率的影响有统计学意义（P=0.001＜0.01），即随着病理分级的增高复发死亡率增高;临床分期对复发死亡率的影响无统计学意义。

　　3 讨论

　　3.1 膀胱癌中MDM2的表达及意义 MDM2基因是一个原癌基因，定位于人第12号染色体长臂（12q1314）上，编码一分子量为90 000（P90）的细胞核磷酸蛋白。该蛋白能与野生型或突变型P53蛋白结合成P90P53复合物，与野生型P53蛋白结合时，可使P53蛋白丧失反式激活作用，即丧失了抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用。在正常组织中，MDM2基因也有表达，但MDM2蛋白的量很少用免疫组化方法检测不到；在一些恶性肿瘤组织中，当MDM2基因扩增或MDM2 mRNA转录增加时，用免疫组化方法能检测到MDM2蛋白。本研究中11例正常膀胱黏膜均未检测到MDM2基因表达，膀胱癌中MDM2阳性表达率为59.03%，且主要见于中高分化的肿瘤细胞，随着肿瘤病理分级的增高，MDM2基因蛋白阳性表达率逐步下降。在临床分期中亦有相同趋势。浅表性膀胱移行细胞癌（TaT1）的MDM2基因蛋白表达率显著高于浸润性膀胱移行细胞癌（T2T4）,且MDM2阳性表达与病理分级及临床分期呈负相关。说明MDM2基因阳性表达与这部分膀胱癌（浅表性和高分化膀胱癌）的发生有关［2］；MDM2对生存率及复发死亡率的影响有统计学意义（P=0.003＜0.01，P=0.001＜0.01），即MDM2阳性表达者生存率高于阴性表达者,复发死亡率低于阴性表达者，提示MDM2与膀胱移行细胞癌生物学关系密切，是膀胱肿瘤早期事件之一，MDM2可作为膀胱肿瘤预后的重要指标。

　　3.2 膀胱癌中P53的表达及意义 P53基因是一个抑癌基因，编码的野生型P53蛋白是一个转录因子，具有调控细胞周期G1/S关键点，抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用。野生型P53蛋白的半衰期为6 min~20 min，用一般的免疫组织化学方法难以检测到，当其突变后编码的突变型P53蛋白的半衰期为6 h，用免疫组织化学方法可检测到,即用免疫组织化学方法可间接检测到P53基因的突变。本研究中11例膀胱黏膜P53阳性表达率为9.09%，膀胱癌中P53表达率为50.6%，P53阳性表达与病理分级呈正相关，多见于浸润性和低分化膀胱癌，与文献［2］报道一致，说明P53基因突变与半数膀胱癌，尤其是浸润性和低分化膀胱癌的发生有关；P53对生存率及复发死亡率的影响有统计学意义（P=0.007＜0.01，P=0.001＜0.01），即P53阳性表达者生存率低于阴性表达者,复发死亡率高于阴性表达者，提示膀胱癌中P53高表达者的治疗效果和预后较差，检测P53可作为判断膀胱肿瘤预后的指标。

　　3.3 细胞凋亡对膀胱癌生物学行为的影响 凋亡细胞指数（apoptotic index,AI）是衡量组织中细胞凋亡发生程度的一项指标，本实验通过检测BTCC肿瘤组织的凋亡细胞，结果显示AI随病理分级和临床分期升高而升高，且各级之间差异有显著性；COX多因数分析TUNEL与复发死亡有关，且复发死亡组明显高于无复发组。提示AI高表达者的治疗效果及预后较差。本研究结果还发现，正常膀胱黏膜组织的AI明显低于BTCC，提示正常膀胱黏膜细胞凋亡明显低于BTCC细胞凋亡。解释在肿瘤组织中随AI的增高，癌病理分级、临床分期及复发死亡率也随之增高，陆磊等［3］认为可能肿瘤细胞发生凋亡是受高增殖潜能的克隆亚群诱导，以使后者能获更好的增殖因素，有利于肿瘤快速增长。解释这一现象Lionen等［4,5］应用形态学标准，检测膀胱癌、乳腺癌中的细胞凋亡指数，发现凋亡指数高者预后差，且凋亡指数和增殖指标呈正相关。对于这一现象，Lionen认为，肿瘤生长到一定程度，肿瘤细胞增殖和死亡维持相对平衡，增殖加快，恶性程度高的肿瘤细胞，凋亡势必会增加。这是因为肿瘤从正常细胞转为肿瘤细胞的过程中，发生浸润、转移是多阶段的，全体细胞达到浸润、转移是一个逐渐发展的过程，肿瘤的一部分细胞还处在癌前细胞阶段，而另一部分细胞已经浸润、转移、走向凋亡。而且肿瘤越发展，肿瘤新陈代谢越加快，走向凋亡的力量越强，结果出现凋亡的细胞多，AI高。当然也存在相反的意见，王自军等［2］的实验结果与本实验相反，他们认为在相对早期的BTCC中，细胞凋亡发生较多，可以暂时地抵消细胞的过度增生，使组织维持平衡；在肿瘤由浅表性向浸润性发展的过程中，细胞凋亡可能起到屏障作用。这就是说，肿瘤的形成是一个复杂的机制，不是由单独的某个因素决定的，生理凋亡是肿瘤发展过程的一个自发现象，不能单独由AI的高低来判断肿瘤的发展和肿瘤的预后。

　　3.4 MDM2、P53基因表达及细胞凋亡对膀胱癌生物学行为的影响 MDM2是P53调控网络中的下游基因，与P53构成降解反式激活循环通路，参与细胞生长抑制、凋亡、细胞周期调控等过程［7］。本研究发现P53阳性表达合并MDM2阳性表达多见于分化好的膀胱癌Ⅰ级、Ⅱ级与Ⅲ级间表达差异有显著性（P＜0.05）,反之,单有P53阳性表达的膀胱癌多见于分化差、浸润性的膀胱癌。据此可将P53基因突变的膀胱癌分为两种：一种为P53基因突变合并MDM2基因阳性表达，这种膀胱癌多为浅表性和分化较好；另一种为P53基因突变不合并MDM2基因表达，这种膀胱癌多为浸润性和分化较差。出现上述结果的可能机制是，仅有P53基因突变，在丧失其正常功能的同时，还能获得某些显性癌基因的作用，突变后获得的显性癌基因作用可能使膀胱癌的侵袭性和恶性度增加，而P53基因突变合并MDM2基因阳性表达时，MDM2蛋白亦能够与突变型P53蛋白结合成复合物，可能使突变型P53蛋白正常功能的丧失，终使膀胱癌的侵袭性和恶性度降低［6］。MDM2是阻断细胞表面β抑制素受体的关键因子，作为连接G蛋白偶联受体介导的细胞外信号与P53的因子，有调节细胞凋亡的作用［7］，本研究中MDM2与AI呈负相关，提示MDM2对AI可能有负调节作用。

　　本实验发现，复发死亡病例AI、P53显著高于生存组（P＜0.05），MDM2则相反，提示在膀胱癌中AI、P53高表达MDM2低表达者的治疗效果及预后较差；复发死亡病例临床分期及病理分级显著高于生存组（P＜0.05）。所以，临床联合运用临床分期及病理分级并检测P53、MDM2可作为判断膀胱移行细胞癌预后的指标。

　　参考文献：

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　　［6］ Li SC,Honkoop AH,Hoekman K,et al.P53and Pglycoprotein are often coexpreed are aociated with poor prognosis in breast cancer［J］.Br J Cancer,1996,74:6368.

　　［7］ 黄越承.MDM2功能及其调控机制［J］．国外医学肿瘤学分册，2004，5（31）：336338.

　　基金项目：云南省教委资助，编号03Y444C

　　(云南省肿瘤医院，云南 昆明 650118)