（20S）人参皂苷Rh2抗癌活性分子靶点的鉴定
2021-10-14 抗癌健康网
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圆形的 |
输入噬菌体 |
洗脱噬菌体 |
洗脱 (%) |
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第1轮 |
1 × 10 11 |
2 × 10 4 |
2 × 10 -5 |
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第二轮 |
1 × 10 11 |
5.6 × 10 4 |
5.6 × 10 -5 |
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第三轮 |
1 × 10 11 |
3.3 × 10 5 |
3.3 × 10 -4 |
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第 4 轮 |
1 × 10 11 |
5.5 × 10 5 |
5.5 × 10 -4 |
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第 5 轮 |
1 × 10 11 |
6 × 10 5 |
6 × 10 -4 |
表格1 使用 (20S)G-Rh2-PEGA 树脂和 T7 Select Human Liver Tumor cDNA 噬菌体文库进行五轮生物淘选后获得的噬菌体滴度。
(20S)G-Rh2 直接与膜联蛋白 A2 结合。（a）等温滴定量热法的结果显示随时间（分钟）测量的结合能（μcal / s）。（插图）单结合位点模型结果显示了相互作用的动力学。（左）每摩尔注射剂测得的能量（千卡）表示结合反应的摩尔比。（b）免疫印迹显示了竞争性 Rh2-pulldown 测定的结果，使用全细胞裂解物（顶部）和纯化的膜联蛋白 A2（底部）进行。（c）分子对接图显示（顶部）膜联蛋白 A2 和周围氨基酸上的潜在结合位点。和（底部) 预测的 Annexin A2（蓝色）和 (20S)G-Rh2（棕色）之间的结合相互作用。（d）竞争性Rh2下拉测定的免疫印迹（IB）结果，用野生型膜联蛋白A2（WT）和膜联蛋白A2 K302A突变体进行。膜联蛋白 A2 蛋白在E中表达。大肠杆菌感受态细胞或 HEK-293T 细胞。（e）细胞热位移测定结果显示（左）HepG2细胞（内源性）或（右）中表达的膜联蛋白A2在不同温度下的相对条带强度变化) 用于在 HEK-293T 细胞中表达的膜联蛋白 A2 野生型 (WT) 和 K302A 突变体构建体（过表达）。所有数据均显示为平均值 ± SD，实验点显示至少三次重复的平均值。所有实验至少重复 3 次。
(20S)G-Rh2 抑制 NF-кB 转录活性并下调抗凋亡基因表达。（a）萤光素酶报告基因测定结果显示（20S）G-Rh2或（20R）G-Rh2如何在不存在（Con）或存在100 ng / mL PMA或25 μg / mL依托泊苷的情况下影响NF-кB转录活性。( b ) 半定量 PCR 结果显示 (20S)G-Rh2 如何影响 IL-2、X-IAP、HIF1-α、Survivin、IL-6、c-IAP1、c-IAP2 和 Bcl-的 mRNA 水平xL，不存在 (-) 或存在 (+) 100 ng/mL PMA 或 25 μg/mL 依托泊苷。所有数据均显示为平均值 ± SD，实验点显示至少三次重复的平均值。所有实验至少重复 3 次。
(20S)G-Rh2 抑制膜联蛋白 A2 与 NF-кB p50 亚基的结合
为了测试 (20S)G-Rh2 在 HepG2 细胞中抑制 NF-кB 活性是否是由膜联蛋白 A2 和 NF-кB p50 亚基之间减弱的相互作用引起的，我们在用 3.75 μg/mL 处理细胞后进行了免疫沉淀（ 20S)G-Rh2 不含或含 NF-кB 激活剂、PMA (100 ng/mL) 或依托泊苷 (25 μg/mL)。在静息细胞和 NF-кB 激活剂处理的细胞中，膜联蛋白 A2 和 NF-кB p50 之间的相互作用显着受到 (20S)G-Rh2 处理的抑制，其中相互作用大大增强（图 3）。 3a）。为了排除其他哺乳动物蛋白可能介导 (20S)G-Rh2 对膜联蛋白 A2 和 NF-кB p50 亚基之间相互作用的抑制作用的可能性，我们在E 中表达了膜联蛋白 A2 和 NF-кB p50 亚基。大肠杆菌BL21，并用这些细胞裂解物进行免疫沉淀。原核细胞表达的膜联蛋白 A2 和 NF-кB p50 亚基相互结合，并且它们的相互作用也很大程度上被 (20S)G-Rh2 抑制（图 3）。 3b）。
膜联蛋白 A2 敲低增强 (20S) G-Rh2 诱导的细胞凋亡。接下来，我们检查了通过基因敲低使膜联蛋白 A2 失活是否降低了 HepG2 细胞中的 NF-кB 活性，如先前在胰腺癌细胞中观察到的那样[16]。报告基因测定表明，在静息状态和 NF-кB 激活剂处理下，与对照细胞相比，膜联蛋白 A2 敲低的 HepG2 细胞中的 NF-кB 活性显着下调（图 4a）。 NF-кB 调节基因的表达，包括 c-IAP1、c-IAP2、X-IAP、Survivin、IL-2 和 IL-6 在 Annexin A2 敲低细胞中也明显下调（图 S3a）。因为，(20S)G-Rh2 有效地抑制了 Annexin A2-p50 复合物的形成和 NF-кB 的激活，我们询问了 (20S)G-Rh2 是否与 Annexin A2 的敲低协同抑制了 NF-кB 的激活和表达下游基因。正如预期的那样，与对照细胞相比，(20S)G-Rh2 对 NF-кB 活性的抑制作用在膜联蛋白 A2 敲低细胞中显着增强（图 4a）。类似地，(20S)G-Rh2 诱导的 c-IAP1、c-IAP2、X-IAP、Survivin 和 IL-6 的下调在膜联蛋白 A2 敲低细胞中比在对照细胞中更显着（图 2）。 4b)。接下来，我们比较了 (20S)G-Rh2 处理后膜联蛋白 A2 敲低细胞与对照细胞的细胞活力。结果表明，Annexin A2 敲低细胞的存活率明显低于（20S）G-Rh2 处理的对照细胞（图 4c，表 2）。在（20S）G-Rh2处理后（图4d和S4b），膜联蛋白A2敲低细胞中半胱天冬酶3和9的活化比对照细胞更明显。此外，与对照细胞相比，PARP切割在膜联蛋白A2敲低细胞中以较低（20S）G-Rh2浓度发生（图4b）。因此，膜联蛋白A2的沉默使得细胞对（20S）G-Rh2处理非常敏感。
(20S)G-Rh2 抑制膜联蛋白 A2 和 NF-кB p50 亚基之间的相互作用。( a ) 免疫印迹显示来自 HepG2 细胞的免疫沉淀蛋白，并在不使用 (-) 或 使用(+) 3.75 μg/mL (20S)G-Rh2、100 ng/mL PMA 或 25 μg/mL 依托泊苷的情况下进行处理。全细胞裂解物的免疫沉淀 (IP) 使用抗 NF-кB p50 亚基抗体（前两行）和抗膜联蛋白 A2 抗体（中间两行）。(b)大肠杆菌。用未标记的膜联蛋白 A2 和 NF-кB p50 亚基转化细胞。混合细胞裂解物并在不使用 (-) 或使用 (+) 3.75 μg/mL (20S)G-Rh2 的情况下进行处理。细胞裂解物用抗 NF-кB p50 亚基抗体免疫沉淀（前两行) 或抗膜联蛋白 A2 抗体（中间两行）。（c）免疫荧光图像显示无（-）或有（+）3.75 μg/mL (20S)G-Rh2处理的HepG2细胞中膜联蛋白A2（红色）和NF-κB（绿色）的分布，也没有处理（ Con) 或使用 100 ng/mL PMA 或 25 μg/mL 依托泊苷 2 小时。( b ) 分离的核蛋白和细胞质蛋白的免疫印迹显示了在指定条件下膜联蛋白 A2 和 NF-кB 的分布。
(20S)G-Rh2 抑制膜联蛋白 A2 介导的 NF-кB 激活抗存活信号转导。（a）萤光素酶报告基因检测结果显示，在存在（sh-NC）或不存在（sh-Annexin A2）膜联蛋白 A2 表达、不存在（con）或存在 3.75 μg/mL (20S)G 的情况下，NF-кB 活化-Rh2 和 100 ng/mL PMA 或 25 μg/mL 依托泊苷。（b）免疫印迹显示暴露于指定浓度的（20S）G-Rh2的HepG2细胞和膜联蛋白A2敲低的HepG2细胞中X-IAP，c-IAP1，c-IAP2和Survivin以及PARP裂解的蛋白质水平。（c）暴露于指定浓度的（20S）G-Rh2 48小时的对照（sh-NC）和膜联蛋白A2敲低（sh-膜联蛋白A2）HepG2细胞中的细胞活力。( d) 暴露于低浓度 (20S)-G-Rh2 的具有正常膜联蛋白 A2 水平 (sh-NC) 或低膜联蛋白 A2 水平 (sh-膜联蛋白 A2) 的 HepG2 细胞中半胱天冬酶 3 和 9 的相对活性。所有数据均显示为平均值 ± SD * P < 0.05、** P < 0.01 和 *** P < 0.001，并且实验点显示至少三次重复的平均值。所有实验至少重复 3 次。使用Student's t-检验进行统计分析。
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(20S)G-Rh2的IC50(μg/mL) |
sh-NC |
sh-膜联蛋白A2 |
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骗局 |
3.128 |
2.886 |
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100 纳克/毫升 PMA |
2.948 |
2.222 |
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25 μg/mL 依托泊苷 |
2.893 |
2.357 |
表 2
在对照 (sh-NC) 或低水平 (sh-Annexin A2) 表达膜联蛋白 A2 的 HepG2 细胞中 (20S)G-Rh2 的 IC50。
Annexin A2 的 K302A 突变体对 (20S)G-Rh2 效应具有抗性
进一步证明 (20S)G-Rh2 对 NF-кB 活性的抑制作用是由 (20S)G-Rh2 与膜联蛋白 A2 蛋白的直接结合介导的。为此，我们检查了膜联蛋白 A2-K302A 的过表达是否使细胞对 (20S)G-Rh2 产生抗性触发信号转导，包括膜联蛋白 A2 和 NF-кB p50 之间的相互作用及其核定位，以及随后在 HepG2 细胞中激活 NF-кB。在野生型膜联蛋白 A2 过表达的 HepG2 细胞中，(20S)G-Rh2 处理明显抑制了膜联蛋白 A2 和 NF-кB p50 亚基之间的相互作用以及这两种蛋白质的核定位。相比之下，膜联蛋白 A2-K302A 和 NF-кB p50 亚基之间的相互作用及其核定位都没有被 (20S)G-Rh2 处理下调， 5a,b）。膜联蛋白 A2-K302A 和 NF-кB p50 亚基之间的相互作用通过（20S）G-Rh2 处理在膜联蛋白 A2-K302A 转染子中增加了（图 2）。 5a）。在（20S）G-Rh2 处理的野生型膜联蛋白 A2 转染细胞中，NF-кB 活性以剂量依赖性方式受到抑制。相比之下，膜联蛋白 A2-K302A 的过表达消除了 (20S)G-Rh2 对 NF-кB 活性的抑制作用（图 3）。 5c）。这些数据表明 (20S)G-Rh2 主要通过靶向 HepG2 细胞中的膜联蛋白 A2 来下调 NF-кB 活性。
我们的下一个目标是为膜联蛋白 A2 是 (20S)G-Rh2 的重要靶蛋白以执行其抗癌活性的观点提供证据。为此，我们检查了膜联蛋白 A2-K302A 的异位过表达是否比野生型膜联蛋白 A2 的过表达更有效地使 HepG2 细胞对（20S）G-Rh2 诱导的细胞死亡具有抗性。MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑）测定表明，野生型膜联蛋白 A2 转染子中 (20S)G-Rh2的 IC 50增加了约 2 倍，并且相对于对照细胞，膜联蛋白 A2-K302A 转染子分别增加了约 3 倍（图 2）。 5天， 桌子 3）。平板克隆形成试验也清楚地表明，膜联蛋白 A2-K302A 转染子比野生型膜联蛋白 A2 转染子更显着地阻止了 (20S)G-Rh2 诱导的细胞死亡（图 2）。 5e)，表明 (20S)G-Rh2 对癌细胞的抗存活活性主要是通过靶向 HepG2 细胞中的膜联蛋白 A2 来实现的。
讨论
(20S)G-Rh2 已被建议抑制癌症的发展、进展和转移[7-10]。我们之前的研究表明，(20S)G-Rh2 触发了 Bax 和 Bak 的线粒体易位，促进了细胞色素c 的释放，并启动了半胱天冬酶 9 依赖性细胞凋亡[4 ,32]。(20S)G-Rh2 还通过上调 Fas 10 来诱导 p53 活化，并触发 caspase 8 依赖性细胞凋亡。许多研究表明，(20S)G-Rh2 诱导的细胞凋亡与细胞周期蛋白 A-Cdk2、PKC-delta 和 JNK1 的激活有关[4,5,11]。 因此，(20S)G-Rh2 可能与多个细胞靶标相互作用，并调节多种信号转导途径。因为 (20S)G-Rh2 的差向异构体 (20R)G-Rh2 在肿瘤细胞中表现出很小的细胞毒性[4,9]，所以 (20S)G-Rh2 的靶标特异性应该决定其独特的功能。因此，探索 (20S)G-Rh2 的细胞靶点是了解其功效和作用机制的关键方法。
在这里，我们进行了噬菌体展示，这是一种广泛用于发现小分子-蛋白质相互作用的系统方法。我们使用 (20R)G-Rh2 作为阴性对照筛选了与 (20S)G-Rh2 显示关键相互作用的蛋白质。幸运的是，我们发现了膜联蛋白 A2，一种促癌蛋白，它可以与 (20S)G-Rh2-PEGA 树脂特异性结合，但不能与 (20R)G-Rh2-PEGA 树脂结合。我们通过等温滴定量热法证明了 (20S)G-Rh2 和纯化的膜联蛋白 A2 之间的相互作用（图 2）。 1a）。竞争性下拉分析进一步证实内源性和纯化的膜联蛋白 A2 特异性结合 (20S)G-Rh2（图 2）。 1b)，但在膜联蛋白 A2 和 (20R)G-Rh2 之间几乎没有观察到相互作用。分子对接表明 (20S)G-Rh2 的最佳结合位点位于 Annexin A2 的结构域 IV 内的凹槽中，此外，lys302 是相互作用中的关键氨基酸（图 1c和S1a )。在另一项使用 Annexin A2 突变版本 Annexin A2-K302A 的竞争性下拉分析中，我们证明了 lys302 处的突变导致 (20S)G-Rh2 结合的丧失（图 3）。 1天）。此外，细胞热位移试验表明，(20S)G-Rh2 可以与活细胞中的膜联蛋白 A2 结合（图 1e和S1b )。这些结果表明膜联蛋白 A2 是 (20S)G-Rh2 的细胞靶标，而 lys302 是膜联蛋白 A2 和 (20S)G-Rh2 之间结合的关键氨基酸。
膜联蛋白 A2 在肿瘤细胞增殖和转移中发挥多种作用[16-21]。之前的一份报告表明，细胞内膜联蛋白 A2 通过与 NF-кB p50 亚基16相互作用，起到抗凋亡因子的作用并增强了耐药性。因此，膜联蛋白 A2 和 (20S)G-Rh2 之间的相互作用可能在功能上与细胞内的 NF-κB 通路有关。正如预期的那样，即使存在 NF-кB 激活剂（依托泊苷或 PMA），（20S）G-Rh2 也能抑制人肝癌 HepG2 细胞中的 NF-кB 活化（图 2）。 2a）。NF-кB、IL-6的一个典型靶基因和重要的抗凋亡基因，包括c-IAP-1、c-IAP-2、X-IAP和Survivin，也受NF-кB调控。 -由 (20S)G-Rh2 调节（图 2b和S2a,b )。免疫沉淀试验表明，膜联蛋白 A2 和 NF-кB p50 亚基之间的相互作用被（20S）G-Rh2 显着抑制（图 2）。 3a）。另一种免疫沉淀试验与E。表达重组膜联蛋白 A2 和 NF-кB p50 亚基的大肠杆菌细胞裂解物也表明 (20S)G-Rh2 抑制了它们的相互作用，表明 (20S)G-Rh2 对形成的抑制作用是在没有任何其他哺乳动物蛋白质的情况下执行的（图. 3b）。此外，膜联蛋白 A2 或 NF-кB p50 亚基的核转位也受到 (20S)G-Rh2 的显着抑制（图 2）。 3c,d)，这可以直接影响 NF-кB 的转录活性。为了确定 (20S)G-Rh2 是否以膜联蛋白 A2 依赖性方式抑制 NF-κB 活化，我们进行了膜联蛋白 A2 的基因沉默或过表达，然后是 (20S)G-Rh2 处理。结果表明，Annexin A2 的下调限制了 NF-кB 的活化，并显示出与 (20S)G-Rh2 的协同作用（图 4a和S3b )。然而，膜联蛋白 A2-K302A 的过表达促进了 NF-кB p50 亚基的核转位并阻止了（20S）G-Rh2 诱导的 NF-кB 抑制，而不管（20S）G-Rh2（图 3）。 5a,b）。总之，这些结果表明，(20S)G-Rh2 主要通过靶向膜联蛋白 A2 来诱导 NF-кB 抑制。
为了研究膜联蛋白 A2 介导的 (20S)G-Rh2 抗癌活性，我们进行了 MTT 和平板克隆形成试验。野生型膜联蛋白 A2 或膜联蛋白 A2-K302A 的过表达使 HepG2 细胞对 (20S)G-Rh2 处理诱导的细胞死亡具有抗性。重要的是，膜联蛋白 A2-K302A 转染子的抗性效果比野生型膜联蛋白 A2 转染子更明显（图 3）。 5d,e, 和表 3）。相比之下，膜联蛋白 A2 的沉默使细胞对（20S）G-Rh2 诱导的细胞凋亡更加敏感（图 4b-d和S4d）。
膜联蛋白 A2 在几种癌细胞系中过度表达，它促进癌细胞存活和转移[12]。为了检查人肝癌中膜联蛋白 A2 的表达，我们通过 Oncomine ( http://www.oncomine.org )分析了已发表的患者数据，Oncomine是癌症转录组数据的免费在线生物信息学资源。它收集来自世界各地不同患者的不同基因的临床 mRNA 阵列数据。如图S6a所示 ，Annexin A2 mRNA水平在肝细胞癌中显着升高（P < 0.001），基于Annexin A2 mRNA水平产生的ROC曲线表明Annexin A2可以作为高精度的生物标志物（AUC > 0.9）在肝细胞癌中（图 S6b）。通过基因沉默或小分子化学抑制剂（如 Withaferin A）抑制膜联蛋白 A2，可显着降低癌细胞生长和肿瘤转移[33]。因此，膜联蛋白 A2 可能是一个重要的靶蛋白，而 (20S)G-Rh2 是一种用于抗肝癌治疗的有前途的天然化合物。
总之，我们证明了 (20S)G-Rh2 直接与膜联蛋白 A2 结合，从而抑制了膜联蛋白 A2 和 NF-кB p50 亚基之间的相互作用。这种干扰通过抑制 NF-кB 活性和下调抗凋亡基因表达来促进细胞凋亡。本研究首次确定了 (20S)G-Rh2 的细胞靶点，我们揭示了 (20S)G-Rh2 如何促进癌细胞凋亡。
图 5. K302A 突变体保护癌细胞免受 (20S)G-Rh2 诱导的 NF-кB 的抑制作用。 HepG2 细胞分别用膜联蛋白 A2-WT-myc 和膜联蛋白 A2-K302A 转染。 (a) 转染细胞不用 (-) 或 (+) 3.75μg/mL (20S)G-Rh2 处理 12 小时，全细胞裂解物用抗 NF-кB p50 亚基抗体、抗 myc 抗体免疫沉淀和抗膜联蛋白 A2 抗体。 (b) 免疫荧光图像显示未经 (-) 或 (+) 3.75μg/mL (20S)G-Rh2 处理 2 小时的转染 HepG2 细胞中膜联蛋白 A2（红色）和 NF-κB（绿色）的分布。 (c) 荧光素酶报告基因检测结果显示，暴露于指定浓度 (20S)G-Rh2 12 小时的转染 HepG2 细胞的 NF-кB 活化。 (d) 将转染的细胞（每孔 1 × 103 个）接种到 6 孔板上并暴露于指定浓度的 (20S)G-Rh2。然后将细胞培养1周，然后进行晶体暴力染色。 (e) 将转染的细胞（每孔 5 × 103）接种到 96 孔板上并暴露于指定浓度的 (20S)G-Rh2。然后将细胞培养 72 小时，然后进行 MTT 测定。所有数据均显示为平均值±SD，实验点显示至少三次重复的平均值。所有实验至少重复 3 次。
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（20S）G-Rh2的IC50（μG/mL） |
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HepG2/载体 |
1.648 |
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HepG2/膜联蛋白A2-WT |
2.879*** |
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HepG2/膜联蛋白A2-K302A |
4.412*** |
表 3. (20S)G-Rh2 在表达膜联蛋白 A2 的宽型和 K302A 突变体的 HepG2 细胞中的 IC50。
材料和方法
细胞系、试剂和质粒。 HepG2 和 HEK-293T 细胞获自美国典型培养物保藏中心 (ATCC, Rockville, MA, USA)。 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM) 购自 Gibco BRL (Grand Island, NE, USA)。使用以下试剂：(20S)G-Rh2 (Sigma)、(20R)G-Rh2 (Sigma)、佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA.Sigma)和依托泊苷(Sigma)。将人参皂苷溶解在 75% 的酒精中。 PMA 和依托泊苷溶解在 DMSO 中。为了用于噬菌体展示，我们购买了来自 Millipore（美国马萨诸塞州）的 T7 精选人肝肿瘤 cDNA 噬菌体文库和宿主大肠杆菌 BLT5615 细菌细胞。我们使用了以下一抗：兔抗 PARP (Santa Cruz)、兔抗 c-IAP1 (Santa Cruz)、兔抗 NF-кB p50 亚基 (Santa Cruz)、兔抗 PCNA (Santa Cruz)、兔抗 myc (Santa Cruz)、兔抗裂解 caspase 3 (Cell Signaling)、兔抗裂解 caspase 9 (Cell Signaling)、小鼠抗膜联蛋白 A2 (Santa Cruz)、小鼠抗 Survivin (Santa Cruz)、小鼠抗 β-肌动蛋白 (Santa Cruz)、小鼠抗 α-微管蛋白 (Santa Cruz)、小鼠抗 X-IAP (Santa Cruz) 和小鼠抗 c-IAP2 (Cell Signaling)。我们使用了以下二抗：HRP 偶联的山羊抗小鼠 IgG (Pierce)、HRP 偶联的山羊抗兔 IgG (Pierce)、Cy™3 affinipure 驴抗小鼠 IgG (Jackson ImmunoResearch Inc., PA,美国）和 Alexa Fluor® 488 affinipure 驴抗兔 IgG（Jackson ImmunoResearch Inc., PA, USA）。我们通过PCR合成了编码人Annexin A2和人NF-кB p50亚基的基因，并将序列克隆到pEXS-CG载体中（中国科学院生物物理研究所孙飞教授课题组提供）。由此产生的原核载体允许表达未标记的膜联蛋白 A2 (pEXS-Annexin A2)、未标记的 NF-кB p50 亚基 (pEXS-p50) 和 C 端 GST 标记的膜联蛋白 A2 (pEXS-CG-膜联蛋白 A2) .为了制备膜联蛋白 A2 突变体，我们在 pEXS-CG-膜联蛋白 A2 结构中设计了一个单点突变，结果称为 pEXS-CG-膜联蛋白 A2-K302A。我们还构建了携带与野生型膜联蛋白 A2 (pcs4-Annexin A2-WT-myc) 融合的 c-myc 和与膜联蛋白 A2 的 K302A 突变体 (pcs4-Annexin A2-K302A-myc) 融合的 c-myc 的真核载体.我们使用短发夹 RNA (shRNA) 载体 pGPU6-GFP-Neo-Annexin A2 来创建 shRNA Annexin A2 基因沉默子，它在 RNA 干扰分析（GenePharma，江苏，中国）中不同程度地降低了 Annexin A2 的表达。使用以下质粒进行荧光素酶报告基因检测：pNFκB-TA-luc（Beyotime，上海，中国）和 pRL CMV（Promega，WI，USA）。
人参皂苷 (20S/R)G-Rh2-PEGA 树脂的合成。我们用吡啶将 750 mg 氨基 PEGA 树脂（Millipore，MA，USA）洗涤 3 次，并加入 0.33 mmol 溴乙酸硝基苯酯（Alfa Aesar，MA，USA）。将树脂在室温下搅拌 3 小时，过滤，并用二氯甲烷 (CH2Cl2)、MeOH 和 N，N-二甲基甲酰胺 (DMF) 各 10mL 洗涤 3 次。溴化PEGA树脂与0.3mmol (20S)G-Rh2和0.3mmol K2CO3在DMF中混合。将混合物在室温下搅拌 3 天，过滤，并用 10mL MeOH 洗涤 3 次。我们以同样的方式制备了 (20R)G-Rh2-PEGA 树脂。 PEGA 树脂在使用前用 TBST（10mM Tris-HCl，pH 8.0，150mM NaCl 和 0.1% TWEEN-20）平衡。
噬菌体展示筛选。我们使用 T7 Select Human Liver Tumor cDNA 噬菌体文库（Millipore，MA，USA）进行了噬菌体展示筛选。通过以高达 1011 噬菌体形成单位 (pfu)/mL 感染宿主细胞来扩增原始文库。然后，将 1 mL 扩增的噬菌体与 100 μL 天然 PEGA 树脂在 4 °C 下孵育过夜以破坏非特异性键。接下来，将 800 μL 预先清除的噬菌体与 200 μL (20S)G-Rh2-PEGA 树脂或 (20R)G-Rh2-PEGA 树脂混合，并在 4°C 下孵育过夜。树脂用1mL TBST洗涤3次，用200 μL洗脱缓冲液（1% SDS）在室温下轻轻摇动孵育30分钟。接下来，将 5μL 洗脱部分接种到 5mL 大肠杆菌 BLT5615 细胞中，并在 37°C 下孵育 3 小时。将噬菌体感染的细胞与 NaCl 混合至终浓度为 0.5M，并以 800×g 离心 5 分钟。上清液用于随后的生物淘选。根据制造商的协议，在生物淘选步骤之前，通过执行噬菌体滴度来确定 pfu 的数量。
所选噬菌体重组体的序列分析。在最后的生物淘选步骤之后，稀释噬菌体以获得单个噬菌斑。将噬菌斑重新悬浮在 100 μL 裂解缓冲液（10 mM EDTA，pH 8.0）中，在 65 °C 下加热 10 分钟，然后短暂涡旋。将裂解物冷却至室温并在 4°C 下以 12,000 x g 离心 3 分钟。上清液作为 PCR 模板，按照制造商的方案进行扩增（引物：5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3' 和 5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'。热循环程序：94°C 1 个循环，5 分钟，然后40 个循环，94 °C 30 秒，然后 58 °C 90 秒，72 °C 90 秒，最后，72 °C 延伸 10 分钟）。序列与存储在 NCBI 数据库中的人类转录组进行比对，该数据库提供了多种基因和肽资源。
分子对接。我们从NCBI Pubchem Compound数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound）下载了（20S）G-Rh2（PubChem CID：119307）的三维结构，我们下载了晶体结构来自 RCSB 蛋白质数据库 (http://www.rcsb.org/pdb) 的膜联蛋白 A2（PDB ID：2HYU）。我们使用默认设置的 AutoDock 工具（版本 4.2.6）执行分子对接，基于拉马克遗传算法（Scripps Research Institute，La Jolla，CA，USA）。我们使用 Discovery Studio 4.0 Visualizer（BIOVIA，CA，USA）处理了综合体的最佳结构。
原核表达的膜联蛋白 A2 的纯化。我们用 pEXS-CG-Annexin A2（GST 标记的构建体）转化大肠杆菌表达菌株 BL21(DE3)，并在含有 50μg/mL 氨苄青霉素的 Luria-Bertani (LB) 液体培养基中在 37°C 下培养细胞直到密度达到 1.5 的 OD600。将细胞冷却至 16°C，并在 16°C 下用 1.0mM IPTG 再培养 12 小时以表达蛋白质。然后，通过以 6,000 rpm（JA10 转子，Beckman）离心 12 分钟来收获细胞。将细胞沉淀重悬在预冷的裂解缓冲液（含有 1mg/mL 溶菌酶、1mM DTT 和 1mM PMSF）的 PBS 中，置于冰上，并超声以进行细胞裂解。裂解的细胞以 12,000 rpm（JA25.50 转子，Beckman）离心 40 分钟分离，上清液上样到 GST 亲和层析柱。用含有 1M NaCl、1 mM DTT 和 1 mM PMSF 的预冷 PBS 洗涤柱子。然后，我们将 10 μg Human HRV 3C Protease (TAKARA) 添加到色谱柱中，并将色谱柱在 4 °C 下孵育过夜，以切割蛋白质 C 末端的 GST 标签。然后将洗脱的部分加载到 Superdex75 16/600 柱（GE Healthcare）上并以 1.0mL/min 的流速洗脱。将级分合并并用 10-kD 截止离心过滤器 (Millipore) 浓缩至 10mg/mL。
膜联蛋白 A2-K302A 突变体用相同的程序纯化。
竞争性 (20S/R)G-Rh2-pulldown 测定。体内：收获HepG2细胞并用含有蛋白酶抑制剂(Roche)的裂解缓冲液(Pierce)裂解。用裂解缓冲液将全细胞裂解物 (2mg) 的等分试样稀释至 500 μL 的最终体积。接下来，将 Rh2 加入稀释的裂解液中，使终浓度为 3.75μg/mL，并在阴性对照制剂中加入相同体积的 75% 酒精。将稀释的裂解液置于旋转搅拌器中，在 4°C 下搅拌 4 小时。最后，收集 20 μL 稀释的裂解液作为输入。接下来，将 10 μL (20S/R)G-Rh2-PEGA 树脂分装并用裂解缓冲液洗涤 3 次。将树脂重新悬浮在稀释的裂解液中，并在 4°C 下再置于旋转搅拌器中 4 小时。去除上清液，用裂解缓冲液洗涤树脂3次。用SDS-PAGE分离蛋白质，并进行免疫印迹以确定膜联蛋白A2的存在。
体外：200 ng 纯化的膜联蛋白 A2 用裂解缓冲液稀释至终体积 500 μL。其余步骤如上文针对体内竞争性 (20S/R)G-Rh2-pulldown 测定所述进行。
等温滴定量热法。 我们使用等温滴定量热法（MicroCal iTC200，Malvern）研究了膜联蛋白 A2 和 (20S)G-Rh2 之间的相互作用。 我们将 40 μL 纯化的膜联蛋白 A2 蛋白 (200 μM) 滴定到样品池中，样品池在室温下含有 200 μL (20S)G-Rh2 (20 mM)。 假设一个结合位点模型进行数据分析。
荧光素酶报告基因检测。 HepG2 细胞 (3 × 105) 接种到 6 孔板中，并用 pNF-кB-TA-luc 和 pRL-CMV 转染。 然后，用指定浓度的 (20S)G-Rh2、PMA 和依托泊苷处理 HepG2 细胞 12 小时。 使用 Dual-Luciferase® Reporter Assay System（Promega，Madison，WI，USA）进行荧光素酶报告基因检测。
免疫沉淀。体内：将 HepG2 细胞（1.6×106）接种到 100φ 板中，并用（20S）G-Rh2、PMA 和依托泊苷处理 12 小时。在含有蛋白酶抑制剂（Roche）的裂解缓冲液（Pierce）中裂解细胞。然后，将 2mg 总蛋白裂解物与 10 μL 抗膜联蛋白 A2 或抗 NF-κB 抗体混合，并在 4°C 下在试管旋转器上孵育 3 小时。蛋白 A/G 珠（Millipore）用裂解缓冲液洗涤 3 次，然后在 4°C 下与裂解抗体复合物孵育 4 小时。蛋白-琼脂糖珠复合物用裂解缓冲液洗涤 3 次。然后用 SDS-PAGE 分离样品并用免疫印迹。
体外：大肠杆菌表达菌株 BL21 (DE3) 的培养物用 pEXS-CG、pEXS-Annexin A2（无标记）和 pEXS-NF-кB 转化。细胞在含有 50 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 液体培养基中于 37°C 培养，直至细胞密度达到 0.4 的 OD600。然后，将细胞用 1mM IPTG 再培养 12 小时。在含有蛋白酶抑制剂和 1mg/mL 溶菌酶的裂解缓冲液 (100mM PBS, 125mM NaCl) 中超声裂解细胞。接下来，将 1mg 含有膜联蛋白 A2 的蛋白质裂解物和另外 1mg 含有 NF-кB 的蛋白质裂解物在 4°C 下与 3.75 μg/mL (20S)G-Rh2 孵育过夜。作为对照，平行孵育 1 mg 不含膜联蛋白 A2 和 NF-κB 的蛋白质裂解物。其余步骤如上文针对体内测定所述进行。
免疫荧光。将玻璃盖玻片放入 24 孔板的孔中，每孔接种 5×104HepG2 细胞。孵育 16 小时后，用 (20S)G-Rh2、依托泊苷和 PMA 处理细胞 2 小时。接下来，将细胞用 4% 多聚甲醛和 4% 蔗糖在 4°C 下固定 20 分钟。然后，用 PBST（含 0.5% Tween-20 的 100mM PBS）洗涤细胞两次。固定的细胞用含有 0.2% Triton X-100 的 PBST 在 4°C 下渗透 20 分钟，然后用 PBST 洗涤 3 次。将透化细胞与封闭缓冲液（含有 3% 驴血清的 PBST）在室温下孵育 1 小时，然后与一抗（小鼠抗膜联蛋白 A2 或兔抗 NF-κB，各稀释 1:200 PBST 与 5% BSA) 在 4°C 下过夜。细胞用 PBST 洗涤 3 次，并与二抗（Cy™3 affinipure 驴抗小鼠 IgG 或 Alexa Fluor® 488 affinipure 驴抗兔 IgG，分别在含 5% BSA 的 PBST 中按 1:200 稀释）孵育 2 小时室内温度。细胞用 PBST 洗涤两次后，将它们固定，用 PBST 和 0.1% DAPI (Sigma) 染色，并用荧光显微镜分析。
细胞热位移测定。将细胞 (3×107) 接种到 100-mm 培养板中，其中含有 7.5μg/mL (20S)G-Rh2，在 37°C 下培养 1 小时。对照细胞与相同体积的乙醇一起温育。培养细胞并计数，然后重悬于 PBS 中至终密度为 2 × 107/mL。每个样品分装到 12 个 PCR 管中，每个 PCR 管 100 μL，并在 40°C 至 73°C 的热梯度下加热 3 分钟。细胞用液氮冻融两次，20,000×g离心20分钟分离上清液。将上清液（20μL）上样到SDS-PAGE凝胶上，将分离的蛋白质转移到膜上进行免疫印迹。
细胞活力测定。用 pGPU6-GFP-Neo-Annexin A2-4 和 pGPU6-GFP-Neo-NC 转染 HepG2 细胞。然后，将细胞（每孔 5 × 103）接种到 96 孔板上，并用（20S）G-Rh2、PMA 和依托泊苷按指定浓度处理 48 小时。用MTT测定确定细胞活力。用pcs4-膜联蛋白A2-WT-myc和pcs4-膜联蛋白A2-K302A-myc转染HepG2细胞。然后，将细胞接种（每孔 5 × 103）到 96 孔板上，并用指定浓度的 (20S)G-Rh2 处理 72 小时。用 MTT 测定确定细胞活力。
平板克隆形成试验。 HepG2 细胞用 pcs4-Annexin A2-WT-myc 和 pcs4-Annexin A2-K302A-myc 转染。 然后将细胞（每孔 1 × 103）接种到 6 孔板上，并用指定浓度的 (20S)G-Rh2 处理 1 周。 细胞用 PBS 洗涤两次，用预冷的甲醇固定 10 分钟，然后结晶紫染色 5 分钟。 然后用PBS洗涤细胞两次并拍照。
半定量 PCR。 用 TRIzol (Invitrogen) 分离全细胞 RNA。 然后，使用 EasyScript 逆转录酶试剂盒 (Transgen) 将 5 毫克等分的全细胞 RNA 用于 cDNA 合成。 使用以下热循环仪程序通过 PCR（表 S1 中显示的引物）扩增基因：1 个循环在 94°C 下 5 分钟，然后是 25 个循环，94°C 30 秒、58°C 30 秒和 72° C 90 秒，最后在 72 °C 下延伸 10 分钟。 PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析。
非肿瘤肝组织和肝细胞癌组织中的基因表达。 我们从 Oncomine™ 数据库 (http://www.oncomine.org) 中检索了关于膜联蛋白 A2 和抗凋亡基因表达水平的数据。 我们使用以下主要过滤器搜索了数据库：“差异分析”=“癌症与正常分析”和“癌症类型”=“肝癌”。 相关基因在 Roessler Liver 中被一一扫描，其中包含 220 个非肿瘤组织样本和 225 个肿瘤组织样本。 图表和统计分析已下载并在此处提供。
统计分析。 数据表示为平均值±标准差。 使用学生 t 检验计算统计显着性。
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